RPHPLC法測(cè)定咽炎片中哈巴俄苷和肉桂酸的含量*

馮 慧,林月英

(天津市大港區(qū)藥品檢驗(yàn)所,天津 300270)

咽炎片用于治療慢性咽炎引起的咽干、咽癢、刺激性咳嗽,具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺,清熱解毒,清咽利喉,鎮(zhèn)咳止癢的功效。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)YBZ24862005,其含量測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定牡丹皮中芍藥苷含量。本品處方君藥為玄參,具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效,用于熱入營(yíng)血、溫毒發(fā)斑、熱病傷陰、舌絳煩渴、津傷便秘、骨蒸勞嗽等癥[1]。為更好地控制本品質(zhì)量,采用高效液相色譜法,測(cè)定玄參中哈巴俄苷和肉桂酸含量,以加強(qiáng)對(duì)咽炎片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀 LC-2010AHT(工作站LC—Solution)。甲醇、乙腈、冰醋酸均為色譜純,純化水;對(duì)照品：哈巴俄苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)

0756-200110 ),肉桂酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào) 0796-200006);樣品：咽炎片 (批號(hào) 20080022、20080026、20080028)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱 DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm),以乙腈為流動(dòng)相 A,以 1%冰醋酸為流動(dòng)相 B,按表1進(jìn)行梯度洗脫[2];檢測(cè)波長(zhǎng)為 278nm;流速為 1ml/min;柱溫 40℃。理論板數(shù)按哈巴俄苷峰計(jì)算不低于 5000。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取對(duì)照品哈巴俄苷10.30 mg,肉桂酸 10.25mg,加甲醇制成每 1ml含哈巴俄苷20.6μg與肉桂酸 20.5μg的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 取“裝量差異”項(xiàng)下本品內(nèi)容物,研細(xì),取 2g,精密稱(chēng)定,置 50ml量瓶中,加入甲醇適量,超聲處理 30min,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例,制備不含玄參的陰性樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備陰性樣品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液 10 μl,注入液相色譜儀,見(jiàn)圖 1,結(jié)果表明陰性無(wú)干擾。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考查 取哈巴俄苷與肉桂酸對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加 30%甲醇使溶解,制成每 1ml中分別含哈巴俄苷 4.12、8.24、16.48、32.96、65.92 μg及肉桂酸 1.23、2.46、4.92、9.84、19.68 μg的混合對(duì)照品溶液,分別精密吸取 10μl,注入高效液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,以對(duì)照品進(jìn)樣的量(μg)和峰面積值進(jìn)行回歸分析,得哈巴俄苷回歸方程：Y=2.544×103X+9.675×103,r=0.9999;肉桂酸回歸方程為 Y=8.863×103X+1.368×104,r=0.9999。結(jié)果表明,哈巴俄苷在 41.2 ～ 659.2μg、肉桂酸在12.3～196.8μg范圍內(nèi)線(xiàn)性良好。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密量取含哈巴俄苷 16.48μg及肉桂酸 4.92μg的混合對(duì)照品溶液 10μl,注入高效液相色譜儀,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,結(jié)果哈巴俄苷的峰面積值的 RSD為 0.19%,肉桂酸的峰面積值的 RSD為 0.38%,結(jié)果符合要求。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(20080022)樣品,共 6份,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,測(cè)定每份樣品中哈巴俄苷和肉桂酸的含量。結(jié)果樣品中哈巴俄苷的平均含量為 0.228mg/g,RSD為 1.4%;肉桂酸的平均含量為 0.0643mg/g,RSD為0.8%,結(jié)果符合要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(20080022)樣品,取 1份,剪碎,取 1g,按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析 ,分別在 0、5、10、15、20、25、30、35和 40h進(jìn)樣,測(cè)定樣品中哈巴俄苷和肉桂酸峰面積,測(cè)得哈巴俄苷峰面積值的 RSD為 1.0%,肉桂酸峰面積值的 RSD為 0.9%,結(jié)果表明供試品溶液在 40h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)(20080022)樣品,取 1 g,共 6份,精密稱(chēng)定,置 50ml量瓶中,分別加入哈巴俄苷對(duì)照品溶液(0.206mg/ml)1ml,肉桂酸對(duì)照品溶液(0.0205mg/ml)3ml,加入甲醇適量,再按照“2.2.2”項(xiàng)下操作,制得供回收率用供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,計(jì)算回收率,結(jié)果哈巴俄苷平均回收率為 103.03%,RSD為 1.97%;肉桂酸平均回收率為98.99%,RSD為 1.77%。試驗(yàn)結(jié)果符合要求。

圖 1 對(duì)照品(A)樣品(B)陰性樣品(C)HPLC色譜圖

2.8 樣品測(cè)定 取 (批號(hào)為 20080022、20080026、20080028)樣品,按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析,測(cè)定各批樣品中哈巴俄苷與肉桂酸含量,結(jié)果見(jiàn)表1。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 提取時(shí)間的選擇 用 30%甲醇作為溶劑處理樣品,考查超聲提取 20、30、40min,結(jié)果表明,超聲處理30min樣品中的哈巴俄苷和肉桂酸含量與 40min結(jié)果相當(dāng),故超聲處理時(shí)間定為 30min。

3.2 流動(dòng)相的選擇 本文采用梯度洗脫的方法同時(shí)測(cè)定哈巴俄苷和肉桂酸兩種成分的含量,在 20min內(nèi)上述兩種成分即可達(dá)到基線(xiàn)分離。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 哈巴俄苷最大吸收波長(zhǎng)為 278 nm,肉桂酸最大吸收波長(zhǎng)為 285nm,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在 278 nm波長(zhǎng)處,供試品色譜中,肉桂酸色譜峰與雜質(zhì)峰達(dá)到基線(xiàn)分離,分離度大于 1.5,因此采用 278nm同時(shí)測(cè)定上述兩種成分的含量。

3.4 本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定玄參中哈巴俄苷和肉桂酸兩種成分含量,為咽炎片的質(zhì)量控制提供了新的方法。

1 中國(guó)藥典.一部.2005：76

2 蔡少青,謝麗華,王建華,等.中藥玄參中哈巴俄苷和肉桂酸的高效液相色譜法的測(cè)定.藥物分析雜志,2000,20(3)：191