人參皂苷Rb3在Caco-2單細(xì)胞層模型上的吸收特征研究Δ

趙潔，楊彩華，胡明，劉中秋（南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，廣州市510515）

人參皂苷Rb3為五加科人參屬植物的主要活性成分之一，在缺血時(shí)可通過抑制神經(jīng)元持續(xù)性鈉電流的增加幅度發(fā)揮對(duì)缺血性神經(jīng)元的保護(hù)作用[1]，具有良好的抗腦缺血、抗血栓以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用[2]。對(duì)于人參皂苷Rb3含量的測定，目前多采用高效液相色譜－紫外分光光度（HPLC－UV）及高效液相色譜－蒸發(fā)光散射（HPLC－ELSD）檢測法[3]。但這些方法受靈敏度及線性范圍的限制，很難準(zhǔn)確定量藥物濃度較低的細(xì)胞樣品。筆者建立了檢測細(xì)胞樣品中人參皂苷Rb3的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧（LC－MS/MS）法，并研究了人參皂苷Rb3在Caco－2單細(xì)胞層模型上的吸收特征，這在國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料

1.1 儀器

6410型液-質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），包括Agilent 1200型高分離快速液相色譜、ESI電噴霧離子源、三重四極桿質(zhì)量分析器；Gradient A10型超純水系統(tǒng)、Millicell－ERS型跨膜電阻儀（美國Millipore公司）；Forma SeriesⅡ型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo electron公司）；TS100－F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Eppendorf 5810R型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；MS 3D型渦旋混勻器（德國IKA公司）；插入式細(xì)胞培養(yǎng)儀（丹麥Nunc公司）。

1.2 試藥

DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白（EDTA，美國Gibco公司）；胎牛血清非必需氨基酸（NEAA，美國Hyclone公司）；谷氨酰胺、青-鏈霉素雙抗溶液、Hank’s液（HBSS，美國Sigma公司）；鼠尾膠原（美國BD公司）；人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2（吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，純度均≥98%）；乙腈、甲酸銨均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞株

細(xì)胞Caco－2 TC7細(xì)胞株，由美國休斯敦大學(xué)胡明教授饋贈(zèng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將Caco－2細(xì)胞接種于T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為DMEM高糖培養(yǎng)基，添加1%NEAA、1%谷氨酰胺、10%胎牛血清、1%青－鏈霉素雙抗溶液，通入5%CO2（相對(duì)濕度90%），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按每1 mL 2×105個(gè)接種于預(yù)先以鼠尾膠原（4.36 mg·mL－1）涂布的含有聚碳酸酯膜的內(nèi)襯皿上。種板后第2天換液，之后隔天換液，19～21 d后測其跨膜電阻，當(dāng)電阻值＞420 ohm時(shí)，表明細(xì)胞分化完全并已形成致密的單細(xì)胞層，符合要求，可用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)。

2.2 藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

試驗(yàn)前以37℃的Hank’s平衡鹽溶液（HBSS液，pH 7.4）輕輕蕩洗細(xì)胞單層3次，測其跨膜電阻，若符合試驗(yàn)要求，則每孔加入2 mL 37℃HBSS液，置于空氣搖床上繼續(xù)孵育1 h，除去細(xì)胞表面的附著物，棄去HBSS液。藥物從絨毛面（AP）側(cè)至基底面（BL）側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)操作為：于AP側(cè)加入人參皂苷Rb3的HBSS液（C010 μg·mL－1、pH7.4）2.5 mL，同時(shí)于BL側(cè)加入空白的HBSS液（pH7.4）2.5 mL。置于37℃轉(zhuǎn)速為50 r·min－1的空氣搖床上，分別于載藥后1、2、3、4 h于BL側(cè)采樣0.5 mL，并于采樣側(cè)補(bǔ)充等體積空白HBSS液，試驗(yàn)平行3份。藥物從BL側(cè)至AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)則將藥物加入BL側(cè)，AP側(cè)加入空白的HBSS液，其它步驟同AP側(cè)至BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)操作。

2.3 細(xì)胞樣品處理

取上述細(xì)胞樣品30 μL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液（每1 mL人參皂苷Rg2含0.5 μg）10 μL，流動(dòng)相加至100 μL，渦旋混合，4 ℃下，13 000 r·min－1離心30 min，取上清液20 μL進(jìn)樣，以樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比進(jìn)行定量分析。

2.4 LC-MS/MS分析

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent RR HT ZORBAX Eclipse XDS-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈-1 mmol·L-1甲酸銨水溶液（34∶66）；流速：0.4 mL·min－1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化方式（ESI），以多重離子反應(yīng)（MRM）、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。檢測條件：人參皂苷Rb3為m/z1077.7→m/z783.4，F(xiàn)ragmentor為 200 V，Collision Energy為58 V；內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg2為m/z783.6→m/z475.1，F(xiàn)ragmentor為270 V，Collision Energy為45 V；離子源參數(shù)：霧化氣溫度為350 ℃，氣流為11 mL·min－1，氣壓為40 psi，毛細(xì)管電壓為4 000 V。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 HBSS溶液中人參皂苷Rb3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白HBSS溶液30 μL，精密加入不同濃度的人參皂苷Rb3標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，使其終濃度分別為50、80、200、400、1 000、2 000 ng·mL－1，按“2.3”項(xiàng)下方法操作。以樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)，樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（R）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。得回歸方程R＝2.865 7C-0.249 7（r＝0.9903）。結(jié)果表明，人參皂苷Rb3檢測濃度在50～2 000 ng·mL－1范圍內(nèi)與樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比呈良好線性關(guān)系。最低檢測限為20 ng·mL－1。

2.5.2 方法的專屬性 在本試驗(yàn)條件下，細(xì)胞中的雜質(zhì)不干擾人參皂苷Rb3、內(nèi)標(biāo)人參皂苷Rg2的檢測，基線噪聲小，人參皂苷Rb3與人參皂苷Rg2的保留時(shí)間分別為3.42、3.68 min。本法具有較好的專屬性。LC-MS/MS圖譜見圖1。

2.5.3 方法回收率試驗(yàn) 取空白HBSS溶液30 μL，精密加入不同濃度的人參皂苷Rb3對(duì)照品溶液10 μL，使其終濃度分別為80、400、2 000 ng·mL－1，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，測定HBSS溶液中人參皂苷Rb3的回收率，每個(gè)濃度重復(fù)5次。人參皂苷Rb3在HBSS溶液中的回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

圖1 LC-MS/MS圖A、B.空白HBSS溶液；C.空白HBSS溶液加入人參皂苷Rb3；D.空白HBSS溶液加入人參皂苷Rg2；E.孵育4 h的人參皂苷Rb3細(xì)胞樣品；F.孵育4 h的人參皂苷Rg2細(xì)胞樣品；E.Rb3標(biāo)準(zhǔn)品；F.Rg2標(biāo)準(zhǔn)品Fig 1 LC-MS/MS chromatogramsA，B.blank HBSS solution；C.blank HBSS solution spiked with ginsenoside Rb3；D.blank HBSS solution spiked with ginsenoside Rg2；E.cell sample after incubating with Ginsenoside Rb3for 4 hours；F.cell sample after incubating with Ginsenoside Rb2for 4 hours；E.standard ginsenoside Rb3；F.standard Ginsenoside Rg2

表1 人參皂苷Rb3在HBSS溶液中的回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Recovery of ginsenoside Rb3in HBSS solution（n＝5）

2.5.4 方法精密度（RSD）試驗(yàn) 取空白HBSS溶液30 μL，精密加入不同濃度的人參皂苷Rb3對(duì)照品溶液10 μL，使其終濃度分別為80、400和2 000 ng·mL－1，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，每天進(jìn)行5樣本測定作為日內(nèi)RSD，連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間RSD，測定日內(nèi)和日間變異情況。結(jié)果，人參皂苷Rb3在80、400、2 000 ng·mL－1水平下，日內(nèi)和日間RSD均＜15%，符合生物樣本的測定要求。

2.6 人參皂苷Rb3的跨膜雙向轉(zhuǎn)運(yùn)特征研究

以10 μmol·L-1的人參皂苷Rb3HBSS溶液通過Caco-2單細(xì)胞層模型，考察其從AP側(cè)至BL側(cè)及BL側(cè)至AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨時(shí)間變化情況。藥物表觀滲透系數(shù)的大小反映了藥物透過單層細(xì)胞的能力以及藥物吸收的速度及程度。其值可由下式計(jì)算：Papp＝ΔQ/（Δt·A·C0）。式中，ΔQ為在Δt時(shí)間內(nèi)藥物透過的量；A為單細(xì)胞層面積，本試驗(yàn)中為4.2 cm2；C0為藥物初始濃度；Papp的單位以cm·s-1表示。結(jié)果，顯示，10 μmol·L-1的人參皂苷Rb3從AP側(cè)至BL側(cè)的Papp為3.22×10-6cm·s-1，BL側(cè)到AP側(cè)的Papp為6.0×10-6cm·s-1，PBL-AP/PAP-BL比值為1.86。人參皂苷Rb3滲透系數(shù)測定結(jié)果見表2。

表2 人參皂苷Rb3滲透系數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 Apparent permeability coefficient（Papp）of ginsenoside Rb3across the Caco-2 cell monolaye（r±s，n＝3）

表2 人參皂苷Rb3滲透系數(shù)測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 Apparent permeability coefficient（Papp）of ginsenoside Rb3across the Caco-2 cell monolaye（r±s，n＝3）

濃度/μmol·L-1 10 Papp/×10-6（cm·s-1）AP-BL 3.22±1.68 BL-AP 6.0±4.71 PBL-AP/PAP-BL 1.86

3 討論

人參皂苷的檢測方法，文獻(xiàn)多以HPLC-UV以及HPLC-ELSD法為主，這些方法受靈敏度及線性范圍的限制，無法滿足細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究定量的要求。因此，筆者建立LCMS/MS法測定人參皂苷Rb3，在流動(dòng)相中添加1 mmol·L-1甲酸銨，能夠改善人參皂苷Rb3峰形、提高進(jìn)樣的響應(yīng)值和重現(xiàn)性。

關(guān)于人參皂苷Rb3的吸收機(jī)制研究國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用Caco-2單細(xì)胞層模型研究人參皂苷Rb3透過單細(xì)胞層的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)特征，結(jié)果顯示，人參皂苷Rb3從AP側(cè)至BL側(cè)以及BL側(cè)至AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)量均隨時(shí)間的增加呈線性升高。其雙向轉(zhuǎn)運(yùn)Papp值均在10-6數(shù)量級(jí)，表明其經(jīng)腸道吸收較差。PBL-AP/PAP-BL為1.86，外排大于吸收，提示人參皂苷Rb3的轉(zhuǎn)運(yùn)可能存在外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與。在腸道中存在P-糖蛋白（P-gp）、多藥抗藥性相關(guān)蛋白（MRPs）等外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以將進(jìn)入BL側(cè)的藥物外排至AP側(cè)，使吸收減少[4]。為考察人參皂苷Rb3的轉(zhuǎn)運(yùn)是否有外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與，本研究采用了高靈敏度的LC-MS/MS檢測方法，并選用較低濃度的人參皂苷 Rb3（10 μmol·L-1）為研究對(duì)象考察其在Caco-2單細(xì)胞層模型上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)特征，避免了可能存在的外排蛋白被飽和現(xiàn)象的影響。結(jié)果表明，人參皂苷Rb3外排大于吸收，這是否由外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白引起，且哪種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與人參皂苷Rb3的外排，有待繼續(xù)深入研究。

[1]江煒煒，姜正林，柯開富.人參皂苷Rb3對(duì)缺血及正常神經(jīng)元持續(xù)性鈉電流的影響[J].藥學(xué)與臨床研究，2007，15（6）：444.

[2]楊志剛.中藥三七對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響[J].中國藥房，2008，19（18）：1 424.

[3]朱 潔，楊 蓉，張洪彬.HPLC-ELSD法測定三七葉中人參皂苷Rb3、Rc、Rb1的含量[J].中草藥，2004，35（12）：1 365.

[4]Patel J，Buddha B，Dey S，et al.In virtro interaction of the Hiv protease inhibitor ritonavir with herbal constituents：changes in P-gp and CYP3A4 activity[J].Am J Ther，2004，11（4）：262.