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      8種頭孢類抗菌藥物無菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證研究

      2010-08-06 06:47:30王偉萍李海芳朱毅忠曹艷玲新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所烏魯木齊830004
      中國藥房 2010年37期
      關(guān)鍵詞:頭孢哌酮青霉素注射用

      王偉萍,李海芳,朱毅忠,曹艷玲(新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,烏魯木齊 830004)

      頭孢類抗生素是β-內(nèi)酰胺類抗生素中的一種,抗菌活性強(qiáng),已成為臨床抗感染治療的主要藥物,用量已占抗感染藥物總用量的20%,并有繼續(xù)增長趨勢。建立該類抗生素注射用滅菌粉末的無菌檢查方法,必須首先有效地消除其抑菌作用,才有可能檢出制劑中污染的微生物,避免假陰性結(jié)果的發(fā)生。本試驗(yàn)采用薄膜過濾法,以不同沖洗量并且加入不同濃度的β-內(nèi)酰胺酶以消除殘留抗生素的抑菌活性,以期建立8種頭孢類抗生素注射用滅菌粉末無菌檢查方法并進(jìn)行驗(yàn)證,同時對試驗(yàn)中應(yīng)注意的問題進(jìn)行了討論。

      1 材料

      1.1 儀器

      HTY-2000A型集菌儀、一次性全封閉集菌培養(yǎng)器(杭州高得醫(yī)療器械有限公司);檢驗(yàn)全過程在潔凈度為100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,其環(huán)境潔凈度為10 000級,嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作,同時做環(huán)境的動態(tài)測定。

      1.2 培養(yǎng)基

      硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基(批號:0211072)、0.1%蛋白胨水溶液(批號:060302)、青霉素酶(批號:20070320,規(guī)格:2 mL,純度:>300萬u·mL-1)均購于中國藥品生物制品檢定所。

      1.3 菌株

      大腸埃希菌(Escherichia coli,批號:CMCC(B)44102)、金黃色 葡萄球 菌(Staphylococcus aureus,批號 :CMCC(B)26003)、銅綠假單胞菌(Pseudomdnas aeruginosa,批號:CMCC(B)10104)、白色念珠菌(Candida albicans,批號:CMCC(F)98001)均購于中國藥品生物制品檢定所,制備成含菌數(shù)為10~100 cfu·mL-1的稀釋液。

      1.4 試藥

      (1)注射用頭孢拉定(蘇州益良藥業(yè)有限公司,批號:20050501,規(guī)格:每支2.0 g);(2)注射用頭孢呋辛鈉(浙江亞太藥業(yè)股份有限公司,批號:060601,規(guī)格:每支1.5 g);(3)注射用頭孢曲松鈉(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司,批號:04108318,規(guī)格:每支1.0 g);(4)注射用頭孢哌酮鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠,批號:20041202,規(guī)格:每支1.0 g);(5)注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉(浙江亞太藥業(yè)股份有限公司,批號:060801,規(guī)格:每支2.0 g);(6)注射用頭孢他啶(海南海靈制藥廠有限公司,批號:0602091,規(guī)格:每支1.0 g);(7)注射用頭孢唑啉鈉(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司,批號:06048009,規(guī)格:每支0.5 g);(8)注射用頭孢噻肟鈉(樂山三九長征藥業(yè)股份有限公司,批號:041101,規(guī)格:每支1.0 g)。

      2 方法[1]

      2.1 菌液與供試品的制備

      分別取經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌肉湯培養(yǎng)物10倍稀釋為10~100 cfu·mL-1,備用;取經(jīng)25℃培養(yǎng)18~24 h的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁,10倍稀釋為10~100 cfu·mL-1,備用。

      2.1.1 試驗(yàn)組:每種樣品各取10支,以無菌操作將其溶解于250~500 mL的0.1%無菌蛋白胨水溶液中,并稀釋至藥液濃度約為20 mg·mL-1,作為供試液備檢;取三聯(lián)無菌檢查用濾器,先用沖洗液(無菌0.1%蛋白胨水溶液)潤濕濾膜,取250 mL供試液過濾,濾干后用沖洗液沖洗,每次沖洗100 mL,沖洗3~5次,濾干后分別灌注規(guī)定量的培養(yǎng)基,每筒分別加入150萬u·100 mL-1或300萬u·100 mL-1的青霉素酶,在陽性對照管中加入10~100 cfu的陽性菌懸液1 mL,按規(guī)定培養(yǎng),逐日觀察結(jié)果。

      2.1.2 試驗(yàn)菌陽性對照組:不加樣品及青霉素酶,只加陽性菌,其他操作同“2.1.1”項(xiàng)。

      2.1.3 樣品組:加樣品及陽性菌,不加青霉素酶,其他操作同“2.1.1”項(xiàng),該樣品組具有抑菌作用。

      2.1.4 陰性對照組:以稀釋液替代樣品液,沖洗液及沖洗量同“2.1.1”項(xiàng),薄膜過濾后加入相同量的培養(yǎng)基。

      表1 8種樣品試驗(yàn)情況Tab 1 The growth state of 8 kinds of samples

      圖1 注射用頭孢呋辛鈉樣品的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)結(jié)果(每筒加入青霉素酶300萬u、沖洗量300 mL)Fig 1 The growth state of Staphylococcus aureus in cefuroxime sodium for injection(300 mL fluid and 3 000 000 u of panicillinase)

      圖2 注射用頭孢唑啉鈉樣品的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)結(jié)果(每筒加入青霉素酶300萬u、沖洗量300 mL)Fig 2 The growth state of Staphylococcus aureus in cefazolin sodium for injection(300 mL fluid and 3 000 000 u of panicillinase)

      2.2 青霉素酶的加入量

      在濃度為1∶100 mL的培養(yǎng)基中加入300萬u青霉素酶,即1 mL青霉素酶原液;在濃度2∶100 mL的培養(yǎng)基中加入150萬u青霉素酶,即0.5 mL青霉素酶原液。以3 d內(nèi)濾器中培養(yǎng)基是否長菌為試驗(yàn)指標(biāo),觀察不同濃度的青霉素酶液對各樣品抑菌活性的消除效果。

      2.3 沖洗次數(shù)

      以2種不同的沖洗次數(shù)進(jìn)行試驗(yàn):(1)每次沖洗100 mL,沖洗3次;(2)每次沖洗100 mL,沖洗5次。觀察沖洗次數(shù)對樣品抑菌活性的影響。

      3 結(jié)果

      3.1 不同沖洗量對消除抑菌活性的影響

      8種樣品試驗(yàn)情況見表1(均為培養(yǎng)1~3 d后的觀察結(jié)果,其中“+”表示有菌生長,“-”表示無菌生長。

      由表1可見,上述8種樣品,在沖洗量為每筒500 mL、加酶量為每筒300萬u的條件下,試驗(yàn)菌均在2 d內(nèi)生長良好。但不同品種在培養(yǎng)相同時間內(nèi)菌株的生長情況不同,如注射用頭孢呋辛鈉和注射用頭孢唑啉鈉在培養(yǎng)24 h后,注射用頭孢呋辛鈉樣品的金黃色葡萄球菌(每筒300萬u青霉素酶,沖洗量300 mL)生長良好,優(yōu)于注射用頭孢唑啉鈉樣品的金黃色葡萄球菌,照片見圖1、圖2。

      另外,注射用頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉最敏感菌為大腸埃希菌,其余樣品最敏感細(xì)菌為金黃色葡萄球菌。

      3.2 相同沖洗量對消除抑菌活性的影響

      在相同沖洗量下,不同加酶量對樣品的抑菌活性的消除力不同,如注射用頭孢他啶在500 mL的沖洗量下,加入300萬u青霉素酶的大腸埃希菌株生長良好(培養(yǎng)48 h后),加入150萬u青霉素酶的大腸埃希菌株未生長(培養(yǎng)48 h后),照片見圖3。

      4 討論

      無菌檢查沖洗量過大,會造成濾膜損傷以及影響細(xì)菌細(xì)胞的滲透壓,造成菌體死亡[2]。本方法采用酶抑制法消除抗菌作用,沖洗量控制在每筒500 mL,為既對濾膜損傷小又能有效清除抗生素殘留的最佳沖洗量。同時,對于對β-內(nèi)酰胺酶不穩(wěn)定的抗生素,可在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中加β-內(nèi)酰胺酶共同培養(yǎng),此方法能使敏感菌在沖洗量較小時即良好生長。

      本次試驗(yàn)中第2代的頭孢呋辛鈉對應(yīng)的敏感菌為大腸埃希菌,第3代的頭孢哌酮鈉和頭孢曲松鈉對應(yīng)的敏感菌為金黃色葡萄球菌。這可能是因?yàn)楸敬卧囼?yàn)是先固定沖洗量再調(diào)整加酶量,與先固定加酶量再調(diào)整沖洗量所得出的敏感菌結(jié)果有所不同。加酶的順序不同,其對菌體的作用機(jī)制可能不同,尚有待進(jìn)一步研究。

      為節(jié)省酶的用量,本次試驗(yàn)對加酶量進(jìn)行了摸索。結(jié)果表明,注射用頭孢拉定、注射用頭孢呋辛鈉、注射用頭孢哌酮鈉、注射用頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉、注射用頭孢他啶、注射用頭孢唑啉鈉、注射用頭孢噻肟鈉均需加酶每筒300萬u,并且沖洗量需每筒300 mL;而注射用頭孢曲松鈉在加酶量每筒150萬u、沖洗量每筒500 mL的條件下,陽性菌即可生長。

      試驗(yàn)中應(yīng)注意進(jìn)行動態(tài)測定,記錄動態(tài)結(jié)果,以保證試驗(yàn)環(huán)境的安全可靠。試驗(yàn)操作細(xì)節(jié)方面,根據(jù)筆者的試驗(yàn)體會,蕩洗這一步非常必要,但操作時難免會沾濕濾筒上部通氣孔上的膜。該膜沾濕后通透性會改變,將不能有效阻擋細(xì)菌,可能會影響試驗(yàn)結(jié)果,故建議將濾筒上部的小膜改為與下部濾膜相同的材質(zhì),建議中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(SOP)上可規(guī)定:“樣品溶液快速濾過后,用沖洗液分次沖洗。每次加入50 mL(或100 mL)沖洗液,振搖蕩洗濾筒后濾過?!?/p>

      圖3 注射用頭孢他啶樣品的大腸埃希菌培養(yǎng)結(jié)果A.每筒加入青霉素酶150萬u、沖洗量500 mL;B.每筒加入青霉素酶300萬u、沖洗量500 mLFig 3 The growth state of Escherichia coli in Ceftazidimefor injectionA.1 500 000 u of panicillinase,500 mL fluid;B.3 000 000 u of panicillinase,500 mL fluid

      [1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:附錄ⅪH.

      [2]張曉明,杜海娟,何曉英,等.抗菌素粉針劑無菌檢查的最佳沖洗量及沖洗方法的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2004,5(1):56.

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