HPLC 法測定大鼠肝微粒體中睪酮的含量

夏宗玲，陳榮，鄒素蘭，王明麗（江蘇常州市第一人民醫(yī)院藥劑科，常州市213000）

目前已發(fā)現(xiàn)與藥物代謝密切相關(guān)的細胞色素P450酶（CYP450）主要有CYP1～4[1]，其中以CYP3A亞族最為重要，占人肝臟CYP450總量的30%，主要成員包括CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5和CYP3A7，成人肝臟中以CYP3A4為主[2]。CYP3A4的底物較多，據(jù)統(tǒng)計大約38個類別共150多種藥物是其底物[3]，約占全部藥物的50%，因此能夠準確地評價CYP3A4的酶活性對藥物相互作用研究以及臨床合理用藥都是十分重要的。目前國內(nèi)、外多采用睪酮作為CYP3A4的探針底物[4，5]，通過測定肝微粒體體外代謝反應(yīng)過程中睪酮的減少量或其代謝產(chǎn)物6-羥基睪酮的生成量來評價該酶的活性。文獻[6，7]報道的高效液相色譜（HPLC）法多采用外標法測定，由于操作過程復雜，從而影響了睪酮的定量，較難準確評價CYP3A4的活性。本研究在借鑒前人研究的基礎(chǔ)上，簡化了樣品處理方法，采用內(nèi)標法建立了一種快速、高效、穩(wěn)定的測定大鼠肝微粒體溫孵體系中睪酮含量的HPLC法。

1 材料

1.1 儀器

HPLC系統(tǒng)，包括2996紫外檢測器、1525雙元梯度泵、717自動進樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，精密度：1×10－5g）；5417R高速臺式離心機（德國Effendorf公司）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；旋渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）；恒溫振蕩水槽（上海精宏儀器設(shè)備有限公司）；雪花制冰機（北京長流科學儀器公司）。

1.2 試藥

睪酮對照品（常州佳爾科藥業(yè)集團有限公司提供，批號：090301，純度：99.3%）；地西泮標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：230-9601，供含量測定用）；乙腈為色譜級；枸櫞酸三鈉鹽、枸櫞酸脫氫酶、氧化/還原型輔酶Ⅱ均購于Sigma-Aldrich（上海）試劑公司。

1.3 動物

Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，體質(zhì)量200～250 g，月齡1.5個月，合格證號：SCXK（滬）2003-0003，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Ultimate-XB C18（250 mm×4.6 mm，4 μm），流動相為水-乙腈（50∶50，V/V），內(nèi)標為地西泮，流速為1.0 mL·min－1，檢測波長為245 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。取空白微粒體、空白微粒體+睪酮+內(nèi)標、37℃下睪酮代謝15 min后的微粒體樣品（含地西泮）進樣測定，記錄色譜，結(jié)果詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白微粒體；B.空白微粒體+睪酮+地西泮；C.微粒體樣品；1.代謝產(chǎn)物；2.睪酮；3.地西泮Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank microsome；B.blank microsome+testosterone+diazepam；C.microsomes sample；1.metabolite；2.testosterone；3.diazepam

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液：精密稱取睪酮對照品約28.836 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻得濃度為10 mmol·L－1的對照品溶液，待用。

2.2.2 內(nèi)標溶液：精密稱取地西泮標準品5.4 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻得濃度為200 μg·mL－1的內(nèi)標溶液，待用。

2.2.3 再生系統(tǒng)溶液：枸櫞酸三鈉鹽2.8 mg，枸櫞酸脫氫酶0.5 mg（相當于10 u），0.15 mol·L－1氯化鎂0.1 mL，0.1 mol·L－1三羥甲基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液（pH 7.4）0.9 mL，混合，可根據(jù)需要按比例制備一定量，臨用新配。

2.3 微粒體的制備

取SD大鼠，斷頭后打開腹腔暴露出肝臟，用冰浴冷卻的生理鹽水經(jīng)胸動脈或門靜脈注入肝臟，直至肝臟顏色變黃后取出肝臟浸入冰冷的生理鹽水中，洗去血水（均在4℃以下操作）。濾紙吸干水分，稱重后加入4倍于肝重的0.25 mol·L－1蔗糖溶液，制成勻漿，于9 000 r·min－1離心20 min，取上清液于19 000 r·min－1離心20 min，分取上清液，加入1/10體積的88 mol·L－1氯化鈣溶液，置于冰浴中5 min，不時攪拌，于27 000 r·min－1離心20 min，除去上清液，在沉淀物中加入pH 7.4的0.1 mol·L－1Tris-KCl緩沖液（含0.15 mol·L－1KCl）混勻，27 000 r·min－1離心30 min，取沉淀物加pH 7.4的50 mmol·L－1Tris-蔗糖緩沖液制成微粒體懸浮液，于－80℃下保存?zhèn)溆谩Ｒ訠CA（Bicinchoninic aicd）法測定微粒體中的蛋白濃度。

2.4 生物樣品處理

取大鼠肝微粒體適量，用新鮮制備的枸櫞酸-枸櫞酸脫氫酶再生系統(tǒng)溶液稀釋成蛋白濃度為1.0 mg·mL－1的混合懸液，充氧氣2 min，取此混懸液0.2 mL，加對照品溶液2 μL，混勻，預孵5 min后，加氧化/還原型輔酶Ⅱ的0.1%NaHCO3溶液（臨用新配，置于冰浴中，終濃度為0.25 mmol·L－1/0.1 mmol·L－1）啟動反應(yīng)，并開始記時，孵育一定時間后加冰冷的乙腈0.2 mL（含20 μL地西泮，終濃度為10 μg·mL－1）終止反應(yīng)，渦旋1 min，15 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進樣，測定代謝反應(yīng)完成后剩余CYP3A4底物睪酮濃度。

2.5 標準曲線的制備

取對照品溶液制備成不同濃度的溶液，依次取2 μL加入經(jīng)60℃加熱失活的大鼠肝微粒體中至200 μL，分別制備成濃度為10.0、25.0、50.0、75.0、200 μmol·L－1的生物標準品（每個濃度平行3份，同時做空白對照），加20 μL的內(nèi)標溶液，180 μL乙腈沉淀蛋白，旋渦振搖1 min，15 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進樣，進行色譜分析。以睪酮峰面積與地西泮峰面積的比值（R）對濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程：R＝0.025 7X+0.035 3（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，睪酮在10.0～200.0 μmol·L－1濃度范圍內(nèi)與R有良好的線性關(guān)系。本實驗睪酮最低檢測濃度為0.76 ng。

2.6 回收率試驗

取對照品溶液制備成不同濃度的溶液，依次取2 μL加入經(jīng)60℃加熱失活的大鼠肝微粒體中至200 μL，分別制備成濃度為15.0、50.0、100.0 μmol·L－1的生物標準品（每個濃度平行5份，同時做空白對照），按“2.5”項下方法處理，進行色譜分析，計算方法回收率（即將所得信號值代入回歸方程，求得測定值，與加入量比較）及相對回收率（即測得睪酮和內(nèi)標峰面積的比值與相同濃度的睪酮和內(nèi)標的純?nèi)芤旱姆迕娣e比值比較），結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery tes（tn＝5）

2.7 精密度試驗

取“2.6”項下低、中、高（15.0、50.0、100.0 μmol·L－1）濃度的生物標準品（每個濃度平行5份，同時做空白對照），按“2.5”項下方法處理，分別在同日內(nèi)測定5次（每隔1 h測定1次）和連續(xù)測定5 d（每天同一時間每個濃度平行測定5份），計算日內(nèi)、日間RSD，結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果（n＝5）Tab 2 Results of precision test（n＝5）

2.8 CYP3A4活性測定

分別取大鼠肝微粒體適量，加入2 μL一定濃度的睪酮溶液，使其終濃度為25 μmol·L－1，加入枸櫞酸-枸櫞酸脫氫酶適量，預孵5 min后，加氧化/還原型輔酶Ⅱ的0.1%NaHCO3溶液5 μL（臨用新配，置于冰浴中，終濃度為0.25 mmol·L－1/0.1 mmol·L－1）啟動反應(yīng)，并開始記時，37 ℃下分別孵育5、10、15 min后，按“2.4”項下方法加冰冷的乙腈處理后，取上清液20 μL進樣，根據(jù)以下公式依次計算出代謝量、反應(yīng)率及反應(yīng)速度，結(jié)果見表3。

表3 不同反應(yīng)時間下大鼠肝微粒體中CYP3A4活性測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Determination results of CYP3A4 activity in mice liver microsomes at different reaction time（n＝3）

W＝W0－Wt（W：代謝量；W0：初始加入睪酮的量；Wt：反應(yīng)t時間后剩余睪酮的量）

由表3可見，隨著反應(yīng)時間的延長反應(yīng)率直線增加，反應(yīng)速度略有增加但無顯著性差異（P＞0.05），表明所制備的大鼠肝微粒體中CYP3A4活性穩(wěn)定可靠，可用于藥物體外代謝研究。

3 討論

近年來新藥上市后因發(fā)生代謝性相互作用原因而退出市場的情況時有發(fā)生[8]，因此了解藥物代謝性相互作用已成為醫(yī)務(wù)人員及患者的迫切要求。為了避免因藥物代謝性相互作用而引起的嚴重不良反應(yīng)的發(fā)生，藥物代謝的研究越來越引起廣大科研人員的重視，目前美國食品與藥品管理局（FDA）已規(guī)定新藥在上市前必須做其代謝研究。由于大部分藥物都是通過CYP450酶催化代謝的，因此通過探針底物測定CYP450酶的活性尤其重要。

CYP3A亞族催化大部分藥物的氧化代謝，而其中也有較多是用于體內(nèi)外分析酶活性的探針底物，如用N-甲基14C標記的紅霉素測定CYP3A4[9]，但這種方法對儀器設(shè)備要求較高，一般實驗室較難達到，故本論文采用睪酮作為探針底物，建立了一種快速、靈敏、準確測定睪酮含量的高效液相色譜法，此法可用于CYP3A4活性的測定。

在內(nèi)標物的選擇上，筆者考察了地塞米松、甲睪酮、氫化可的松、可的松、胺碘酮、卡馬西平、米達唑侖、茶堿、苯妥英鈉等，最終發(fā)現(xiàn)地西泮無論在出峰時間、峰形，還是分離度方面都是最佳選擇。

在反相液相色譜條件下，乙腈洗脫能力優(yōu)于甲醇，可以得到相對較高柱效的睪酮峰，且使睪酮與內(nèi)標得到很好分離，故選擇乙腈-水＝50∶50的比例作為流動相。

[1]Nelson DR，Kamataki T，Waxman DJ，et al.The P450superfamily：update on new sequences，gene mapping，accession numbers，early trivial names of enzymes，and nomenclature[J].DNA Cell Biol，1993，12（1）：1.

[2]Imaoka ST，Yamada T，Hiroi K，et al.Muitiple forms of human P450expressed in saccharomyces cerevisiae，systematic characterization and comparison with those of the rat[J].Biochem Pharmacol，1996，51（8）∶1 041.

[3]Yamano S，Tatsuno J，Gonzale FJ.The CYP2A3 gene product catalyzes coumarin 7-hydroxylation in human liver microsomes[J].Biochemistry，1990，29（5）∶1 322.

[4]Caroline AL，Sue HK，Thomas AK，et al.CYP3A4 expressed by insect cells infected with a recombinant baculovirus bontaining both CYP3A4 and human NADPH-cytochrome P450reductase is catalytically similar to human liver microsomal CYP3A4[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，1995，319（1）：157.

[5]Arthur GR，William MA.Energetics of heterotropic cooperativity between a-naphthoflavone and testosterone binding to CYP3A4[J].Archives of Biochemistry and Biophysics，2007，463（1）：89.

[6]張 榮，劉昌輝，王寧生，等.以睪酮為探針采用高效液相色譜法測定細胞色素CYP4503A4的酶活性[J].色譜，2008，26（1）：80.

[7]Jessica LF，David MP，Barbara JR，et al.A novel testosterone 6b-hydroxylase activity assay for the study of CYP3A-mediated metabolism，inhibition，and induction in vitro[J].J Pharmacol Toxicol Methods，2002，46（2）：117.

[8]張石革.若干處方藥撤出市場的回顧與思考[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2002，4（1）：14.

[9]Rile RJ，Howbrook D.In vitro analysis of the activity of the major human hepatic CYP enzyme（CYP3A4）using[N-methyl-14C]-erythromycin[J].J Pharmacol Toxicol Methods，1997，38（4）：189.