我國雞群禽戊型肝炎病毒RT-PCR檢測及部分ORF2基因序列分析

趙 欽，周恩民，孫培明，董施偉，張 璐，孫亞妮，姜世金1,2,

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院“泰山學(xué)者”免疫生物學(xué)實驗室，山東泰安271018；2.山東省動物生物技術(shù)與疫病防控重點實驗室，山東泰安271018；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)系，山東泰安271018)

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)屬于肝炎病毒屬，為無囊膜、單股正鏈RNA病毒。禽HEV由Ritchie等經(jīng)患有肝脾腫大綜合征(Hepatitissplenomegaly syndrome，HSS)的病雞組織中分離得到[1]，通過血清學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)查，證實了禽HEV為HSS主要病原[3-5]。我國部分地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查表明：雞群中禽HEV的血清抗體陽性率達到30%左右[6-7]。禽HEV基因組全長約6.6 nt，包含3個開放閱讀框(ORF)，分別為 ORF1、ORF2和ORF3。已有研究報道采用RT-套式PCR方法對禽HEV進行檢測[2-4,7]，其中Sun等設(shè)計的針對ORF2基因保守序列的引物得到了廣泛應(yīng)用[7]，Bilic等利用該引物對歐洲部分國家和澳大利亞的禽HEV感染狀況進行了檢測，發(fā)現(xiàn)以該引物擴增的序列構(gòu)建的進化樹與以全基因組序列構(gòu)建的進化樹一致[4]。本實驗從山東省某雞場收集糞便和肝脾腫大雞的膽汁，利用Sun設(shè)計的引物[7]進行禽HEV ORF2基因的檢測，并對獲得的部分禽HEV ORF2基因片段與其它國家的參考序列進行比較分析。

1 材料和方法

1.1 樣品來源 10份雞糞便和8份膽汁樣品采自山東省某肉種雞場HSS病雞。糞便進行預(yù)處理，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引 物 參照文獻[7]方法，合成擴增ORF2部分序列的套式PCR引物，外側(cè)引物序列為ORF2/F-1/SD：5'-TCGCCT(C)GGTAAT(C)ACA(T)AAT GC-3'，ORF2/R-1/SD：5'-GCGTTC(G)CCG(C)AC AGGT(C)CGGCC-3'；內(nèi)側(cè)引物序列為ORF2/F-2/SD：5'-ACA(T)AATGCT(C)AGGGTCACCCG-3'，ORF2/R-2/SD：5'-ATGTACTGA(G)CCA(G)CTG(C)GCCGC-3'，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，目的片段分別為278 bp和242 bp。

1.3 糞便和膽汁樣品中禽HEV RNA的檢測 參照文獻[7]的RT-PCR程序，用TRIzol試劑(Invitrogen)從140 μL 10%糞便上清和膽汁中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以cDNA為模板，采用引物ORF2/F-1/SD和ORF2/R-1/SD進行ORF2部分基因的第一次PCR擴增，反應(yīng)條件為：95℃10 min；95℃45 s、48℃ 45 s、72℃ 45 s，39個循環(huán)；72℃10 min。以該產(chǎn)物為模板，采用引物ORF2/F-2/SD和ORF2/R-2/SD進行第二次擴增，反應(yīng)條件中退火溫度為54℃，35個循環(huán)，其余條件同第一次PCR。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析 瓊脂糖凝膠純化與回收PCR產(chǎn)物，連接pMD18-T載體，陽性重組質(zhì)粒由南京金思瑞生物科技公司進行測序。將獲得的序列采用生物學(xué)軟件與NCBI上登錄的序列(EU919193～EU919196、 FM872311～FM872320和AY870812～AY870831)進行同源性和進化樹分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品檢測結(jié)果 10份雞糞便樣品中，7份樣品能用禽HEV ORF2引物擴增出大小約為250 bp的目的片段；8份雞膽汁樣品中，6份擴增出目的片段(圖1)。證明已利用該引物檢測到禽HEV RNA，從病毒的核酸水平證實禽HEV感染的存在。這是我國首次報道禽HEV核酸檢測陽性。

2.2 禽HEV部分ORF2基因序列的測定與分析獲得的13份陽性樣品序列均為242 bp禽HEV ORF2基因的部分片段。挑選其中的4個序列錄入GenBank，序列號 分 別 為 GQ398039、GQ398040、GQ398041和GQ398042，分別命名為China 09-Z56，China 09-A5，China 09-B3和China 09-G57。13個序列的同源性在97.1%～98.3%之間，具有很高的同源性，這可能是樣品來自同一雞場的原因；與其它國家的禽HEV參考序列同源性為77.3%～95.5%，其中與歐洲的病毒株同源性最高，為95.5%～97.6%，可能是由于本實驗所用種雞是由歐洲某種雞場引進的有關(guān)；而與美國的和西班牙來源的禽HEV的序列之間同源性較低，為77.3%～77.9%。同時，本實驗獲得的序列與其它國家的禽HEV參考序列構(gòu)建的進化樹顯示，與歐洲的在同一分支上，同屬禽HEV基因3型(圖2)，證實了Bilic等指出的禽HEV基因分型的地域性特點[4]，但其與致病性的關(guān)系則有待進一步的實驗研究。

[1]Ritchie S J,Riddell C.'Hepatitis-splenomegaly'syndrome in commercial egg laying hens[J].Can Vet J,1991,32:500-501.

[2]Huang F F,Haqshenas G,Shivaprasad H L,et al.Heterogeneity and seroprevalence of a newly identified avian hepatitis E virus from chickens in the United States[J].J Clin Microbiol,2002,40(11):4197-4202.

[3]Peralta B,Biarne'sM,Ordo'nez G,etal.Evidence of widespread infection of avian hepatitis E virus(avian HEV)in chickens from Spain[J].Vet Microbiol,2009,137:31-36.

[4]Bilic I,Jaskulska B,Basic A,et al.Sequence analysis and comparison of avian hepatitis E viruses from Australia and Europe indicate the existence of different genotypes[J].J Gen Virol,2009,90:863-873.

[5]梁久紅，孟繼鴻.人、豬、禽戊型肝炎病毒血清學(xué)關(guān)系的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2007，27：581-586.

[6]張璐，周恩民，崔治中，等.禽戊型肝炎血清學(xué)調(diào)查以及與肝脾腫大綜合征關(guān)系的研究[J].中國家禽，2008，30(20)：22-25.

[7]Sun Z F,Larsen C T,Dunlop A,et al.Genetic identification of avian hepatitis E virus(HEV)from healthy chicken flocks and characterization of the capsid gene of 14 avian HEV isolates from chickens with hepatitis-splenomegaly syndrome in different geographical regions of the United States[J].J Gen Virol,2004,85:693-700.