正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化沙棘黃酮的提取工藝*

侯 霄

(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院中藥室,山西太原 030006)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名沙棗、醋柳、酸刺等,是我國(guó)蒙醫(yī)、藏醫(yī)傳統(tǒng)習(xí)用藥材。1977年首次被衛(wèi)生部正式收載于 《中國(guó)藥典》,之后又被頒布為藥食兩用品種,具有活血散瘀、止咳祛痰、消食化滯的功效[1]。沙棘在我國(guó)藥用歷史悠久,早在唐代 《月王藥診》、《四部醫(yī)典》和清代 《晶珠本草》中均記載了沙棘的醫(yī)藥用途。沙棘黃酮是沙棘總黃酮 (Total flavones of Hippophae rhamnoides L.)的簡(jiǎn)稱(chēng),是沙棘中含有多種黃酮成分的一組化合物,主要包括槲皮素、異鼠李素、山奈酚及其苷類(lèi)蘆丁等成分[2]。沙棘黃酮是沙棘中的重要活性成分,具有抗心肌缺血、抗心率失常,提高耐缺氧能力、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、促進(jìn)創(chuàng)傷面的愈合、提高免疫力、抗氧化、抗輻射等廣泛的藥理功效[3]。為了提高產(chǎn)品質(zhì)量,保證藥品療效,本文對(duì)沙棘黃酮的提取工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)研究,從中優(yōu)選出最佳提取工藝條件,為制劑工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

290SCS電子天平 (瑞士PRECISA),GZX-9076MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海博迅),HH-4恒溫水浴鍋(常州國(guó)華),SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵 (鄭州長(zhǎng)城),UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (上海精科),RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮),HC-3518高速離心機(jī) (科大創(chuàng)新)。

1.2 材料

沙棘果于2008年10月采自山西省沁源縣魚(yú)兒泉產(chǎn)地,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所 (批號(hào)100080-200707,含量92.5%),乙醇、石油醚 (60～90℃)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純,試驗(yàn)用水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理

2.1.1 備料

取上述自然干燥的沙棘果洗凈,置鼓風(fēng)干燥箱60℃烘干,粉碎,過(guò)20目篩,藥粉密封,放入干燥器中備用。試驗(yàn)開(kāi)始前用感量0.1g天平準(zhǔn)確稱(chēng)取沙棘果粉5.0g,設(shè)計(jì)16個(gè)正交試驗(yàn)組合,重復(fù)3次,共計(jì)稱(chēng)量48份實(shí)驗(yàn)材料。

2.1.2 脫脂

正交實(shí)驗(yàn)前先用石油醚 (沸程60～90℃)脫脂兩次,第1次:將稱(chēng)量好的沙棘果粉5.0g裝入100ml燒瓶中加入40ml石油醚,安裝回流提取裝置,水浴加熱70℃提取1.5h,取下燒瓶,過(guò)濾,分離原料與石油醚提取液。第2次:將上述石油醚提過(guò)一次的原料加入30ml石油醚,水浴加熱70℃,回流提取1h,過(guò)濾,合并兩次石油醚過(guò)濾液,放入另外的容器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,并參考文獻(xiàn)資料報(bào)道[4],確定以80℃為乙醇提取溫度,以沙棘總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),綜合考察影響乙醇回流提取沙棘黃酮的主要因素,如:乙醇濃度、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素,每個(gè)因素分別設(shè)計(jì)4個(gè)不同水平,最后確定因素水平見(jiàn)表1、正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表2。通過(guò)L16(45)正交試驗(yàn)篩選研究,最終優(yōu)選出沙棘黃酮提取工藝的最佳條件。

表1 因 素 水 平 表

表2 L16(45)正交試驗(yàn)安排與結(jié)果

2.2.2 樣品溶液制備

分別取上述稱(chēng)量、脫脂后的沙棘果粉原料,按照表2 L16(45)正交表具體工藝條件,進(jìn)行4因素4水平的組合實(shí)驗(yàn),重復(fù)3次。分別收集每一組號(hào)的抽濾液,離心5min(10000r/min),離心液加入250ml容量瓶中,以相應(yīng)提取時(shí)的乙醇濃度定容,搖勻。分別精密量取 25ml加入50ml容量瓶中,加蒸餾水定容,搖勻,作為供試品溶液。

2.3 含量測(cè)定

按照2005年版藥典一部沙棘項(xiàng)下總黃酮含量測(cè)定方法進(jìn)行。

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精確稱(chēng)取在120℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20.08mg,置于50ml量瓶中,加入適量60%乙醇,置水浴上微熱使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,搖勻。精確量取25ml,置50ml量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得 (每1ml中含無(wú)水蘆丁0.19mg)對(duì)照品溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精確量取對(duì)照品溶液 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml與6ml,分別置于25ml量瓶中,各加30%乙醇溶液至6ml,加5%亞硝酸鈉溶液1ml,搖勻,放置6min,再加10%硝酸鋁溶液 1ml,混勻,放置6min,加氫氧化鈉試液10ml,再加30%乙醇至刻度,搖勻,放置15min,以相應(yīng)試劑為空白,照紫外可見(jiàn)分光光度法,在500nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1,計(jì)算得直線(xiàn)回歸方程:A=0.4105C-0.0165(r=0.9967)。

表3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3.3 樣品溶液的測(cè)定

分別在上述2.2.2制備的50ml量瓶中量取3ml供試品溶液,置于 25ml容量瓶中,各加30%乙醇3ml至6ml,照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備項(xiàng)下的方法,自 “加5%亞硝酸鈉溶液1ml”起,以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,依法測(cè)定吸光度。通過(guò)上述2.3.2得到的直線(xiàn)回歸方程,分別計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組合的濃度。

總黃酮含量=提取的總黃酮質(zhì)量/沙棘果粉質(zhì)量=CV/W

即可求出各實(shí)驗(yàn)組合的總黃酮含量,結(jié)果見(jiàn)表2。分別對(duì)其進(jìn)行極差分析和方差分析,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方差分析

3 討論與小結(jié)

(1)目前從沙棘中提取總黃酮的方法一般有水浸提取、有機(jī)溶劑提取、超臨界CO2流體提取、微波法提取和超聲波法提取等,用水浸提取沙棘總黃酮提取率一般偏低,超臨界CO2萃取適用于非極性化合物的分離,微波法和超聲波法提取目前僅限于少量提取實(shí)驗(yàn),還不具備工業(yè)化大生產(chǎn),有機(jī)溶劑提取中甲醇和丙酮含有毒成分,因此,用乙醇提取沙棘黃酮是目前適合工業(yè)化大生產(chǎn)的安全適宜方法。

(2)在用乙醇提取之前先用石油醚預(yù)處理沙棘原料,這樣提取液可生產(chǎn)沙棘油,同時(shí)可除去油脂、色素等雜質(zhì),以免影響后續(xù)黃酮的提取與測(cè)定。

(3)2005年版 《中國(guó)藥典》規(guī)定:沙棘果以干燥品計(jì)算,含總黃酮以無(wú)水蘆丁計(jì),不得少于1.5%。在本文的16個(gè)正交實(shí)驗(yàn)提取組合中,除15號(hào)、16號(hào)沙棘總黃酮含量低于1.5%外,其余14個(gè)組合沙棘總黃酮含量均高于1.5%,最高達(dá)2.94%,說(shuō)明山西沁源沙棘果黃酮含量較高。同時(shí),初步說(shuō)明沙棘黃酮極性較大,不適宜高濃度乙醇提取,并且只用乙醇回流提取1-2次,沙棘黃酮含量較低。

(4)由表2中極差R值大小顯示,沙棘總黃酮含量RA＞RC＞RD＞RB,各因素作用主次為A＞C＞D＞B,根據(jù)各因素水平均值可知,最佳工藝條件為A1B4C4D2;由表4方差分析結(jié)果表明,A 、C因素的影響具有顯著性意義 (P＜0.05),B、D因素的影響無(wú)顯著性意義 (P＞0.05)。根據(jù)制劑經(jīng)驗(yàn),結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,為了縮短生產(chǎn)周期,合理降低生產(chǎn)成本,最后確定沙棘黃酮最佳提取工藝條件為 A1B3C3D2,即用50%乙醇提取沙棘果粉3次,第一次加藥材質(zhì)量的10倍乙醇量,提取2小時(shí);第二次加藥材質(zhì)量的10倍乙醇量,提取1小時(shí);第三次加藥材質(zhì)量的8倍乙醇量,提取1小時(shí)為佳。三批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)總黃酮含量為2.80%,結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行。

(5)山西省是我國(guó)沙棘藥材的主要產(chǎn)區(qū)之一,沁源縣是山西省沙棘資源產(chǎn)量最大的縣區(qū),并且通過(guò)本文研究證明,沁源沙棘總黃酮含量高出 《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn),有望在此地區(qū)建立沙棘GAP種植基地,更好地開(kāi)發(fā)利用沙棘藥材資源,促進(jìn)沙棘產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].2005年版一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,127-128.

[2] 高錦明,張鞍靈,李蕓生等.沙棘黃酮化學(xué)研究的進(jìn)展[J].沙棘,1998,11(2):34-37.

[3] 劉鳳云.沙棘總黃酮的藥理研究概況[J].中藥材,2004,27(2):145-147.

[4] 王大林.正交試驗(yàn)在中成藥制備工藝中研究應(yīng)用的概況[J].中成藥,1997,19(11):41-43.