牛κ酪蛋白基因變異及其與奶用性狀的關系

祁 宏,苗永旺＊,2

(1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院,云南昆明 650201;2.云南大學云南省生物資源保護與利用重點實驗室,云南昆明 650091)

κ酪蛋白是最重要的酪蛋白之一,它不僅在酪蛋白微團的穩(wěn)定性方面起至關重要的作用,而且對奶牛泌乳性能及乳成分組成和奶酪品質均有一定程度的影響。牛κ酪蛋白由169個氨基酸殘基組成,其編碼基因從轉錄起始位點算起有近13 kb,由5個外顯子和4個內(nèi)含子構成。牛κ酪蛋白共發(fā)現(xiàn)有11種變異體,均由核苷酸非同義替換造成。許多研究結果表明,牛κ酪蛋白基因可能會影響乳牛的產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率,而且對牛乳的凝固特性和奶酪產(chǎn)量有顯著影響。牛κ酪蛋白變異體之間對奶酪生產(chǎn)的影響可能是由編碼序列的多態(tài)性引起的,而泌乳性狀與κ酪蛋白基因型之間的關系可以用基因調(diào)控區(qū)存在突變來解釋。

牛乳中含有大量蛋白質,其中酪蛋白約占牛乳總蛋白的80%[1]。κ酪蛋白是最重要的酪蛋白之一。牛κ酪蛋白(kappa-casein,κ-CN,CSN3)家族的參比蛋白是κ-CN A-1P,其 ExPASy登錄名為CASK Bovin,登錄號為P02668。它由169個氨基酸殘基組成 ,富含 Pro、Gln、Thr、Ala等氨基酸,分子量為19 037,其信號肽由 21個氨基酸殘基組成[2]。凝乳酶可水解κ-CN 105和106位點之間的肽鍵,其產(chǎn)物為側κ酪蛋白和巨肽[3],此反應可使牛乳凝固[4]。側κ酪蛋白是疏水的,而巨肽是親水的。κ-CN的疏水部分與牛乳中三種鈣敏感酪蛋白(α s1,α s2,β酪蛋白)結合,而親水部分則暴露在牛乳酪蛋白微團的外面。正是這種兩性電解質的特性,使得κ-CN在形成酪蛋白微團的過程中發(fā)揮著重要的作用。同時,也正是由于具有這一重要的功能,此水解位點及κ-CN在進化上相對比較保守[5]。κ-CN不僅在酪蛋白微團的穩(wěn)定性方面起至關重要的作用,而且對奶牛泌乳性能及乳成分組成和奶酪品質均有一定程度的影響。但是這些方面的研究結果不盡一致,而且對它們的作用機理尚無深入研究。

1 κ酪蛋白的基因結構

牛κ酪蛋白基因(CSN3)的cDNA序列和核苷酸全序列分別于 1984年和 1988年被公布。牛CSN3的開放閱讀框包含573個核苷酸[6]。CSN3從轉錄起始位點算起有近13 kb,由5個外顯子和4個內(nèi)含子構成。第 1外顯子由5′非翻譯區(qū)(Untranslated Region,UT R)的65個核苷酸構成,第2外顯子包含5′-UTR的后5個核苷酸并且編碼前導肽氨基酸的前19個氨基酸,第3外顯子僅有33個核苷酸,第4外顯子除編碼成熟蛋白質中剩余的氨基酸外還包括3′-UTR的37個核苷酸,剩余的173個核苷酸在第5外顯子之中。CSN3各內(nèi)含子長度分別為2.5 kb,5.8 kb,2.0 kb和1.8 kb。在其第2和第3內(nèi)含子中有7個偶蹄獸Alu樣重復序列A家族序列和1個C家族序列。與這些重復序列和外顯子相比,內(nèi)含子的其余部分富含AT。CSN3 5′側翼序列包含TATA框和CAAT框,在-54開始的區(qū)域內(nèi)存在與轉錄因子AP-1(Activator Protein l)識別序列相似的序列,在第4外顯子上游區(qū)也有其它可能的調(diào)控序列[7]。

2 κ酪蛋白的基因多態(tài)性

Farrell等(2004)在牛乳蛋白多態(tài)性命名的最新修訂版中提出,牛屬動物的κ酪蛋白共發(fā)現(xiàn)有11種變異體[2],各變異體名稱及其在蛋白質和DNA上的對應關系見表1。κ-CN最常見的兩個遺傳變異體是A和B,它們在136和148位氨基酸有差別,A的兩位點分別為Thr和Asp,而B為Ile和Ala[8],相應的核苷酸替換分別為ACC※ATC和GAT※GCT。C變異體于1979年被 Di Stasio發(fā)現(xiàn),E變異體于1989年被 Erhardt發(fā)現(xiàn)[9]。Miranda等[10]指出C的97位為His,E的155位為Gly,而A在這兩位點分別為Arg和Ser,相應的核苷酸替換分別為CGT※CAT和AGC※GGC。Seibert等[11]通過對脫脂牛乳進行等電聚焦(Isoelectric Focusing,IEF),發(fā)現(xiàn)了κ-CN D,但后來經(jīng)證實其為κ-CN C。這提醒人們要鑒定所有的κ-CN變異體光靠電泳技術是不夠的,需要測定其氨基酸序列或編碼基因核苷酸序列才能正確區(qū)分所有的變異體,后來的變異體多是采用PCR技術結合其它技術發(fā)現(xiàn)的。1992年Sulimova等在瘤牛中發(fā)現(xiàn)F1變異體,它的148位氨基酸為Val[2]。Erhardt[9]通過IEF和堿性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)在Pinzgauer牛中發(fā)現(xiàn)G1變異體。隨后Prinzenberg等[12]用 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)技術把 CSN3F2和CSN3G1與其它變異體區(qū)別開來。測序結果表明,CSN3F2存在的突變位點為G10530A,CSN3G1存在的突變位點為C10790T;由此推測CSN3F2的第10位氨基酸由Arg變?yōu)镠is,CSN3G1的第97位氨基酸由Arg變?yōu)镃ys。Sulimova等[13]通過相同方法在牦牛和歐洲野牛群中發(fā)現(xiàn)CSN3G2,其與A的區(qū)別在于它的148位氨基酸為Ala,其核苷酸替換為GAT※GCT。Prinzenberg等[14]通過高分辨率SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)法鑒定了新的多態(tài)體H和I,經(jīng)測序推導出的氨基酸序列顯示,H的135位為Ile,I的104位為Ala,其相應的核苷酸替換分別為ACC※ATC和TCA※GCA。Mahé等[15]從非洲的 Baoulé牛中發(fā)現(xiàn)了 κ-CN J變異體,它與B變異體的差別在于其155位氨基酸為Arg,而B為Ser。由上可知,κ-CN的變異體都是由非同義核苷酸替換造成,而不存在缺失或插入的情況,核苷酸非同義替換導致了編碼氨基酸的改變。

表1 已發(fā)現(xiàn)的牛κ酪蛋白變異體

3 κ酪蛋白基因多態(tài)性與奶用性狀的相關性

自發(fā)現(xiàn)牛κ酪蛋白有遺傳變異體以來,各國學者就一直試圖尋找其基因型和生產(chǎn)性狀之間的聯(lián)系。牛CSN3第4外顯子因編碼約94%的成熟蛋白質,而成為眾多學者研究的焦點。其與泌乳性能及乳成分組成之間的關聯(lián)性研究,多采用 PCRRFLP技術分型并結合統(tǒng)計模型分析的方法。已有的關于其基因分型及不同基因型對相關性狀影響的研究結果見表2。趙春江等[16]認為乳蛋白基因位點效應對產(chǎn)奶量的影響不顯著,且CSN3與乳成份沒有顯著相關。Lara等[17]發(fā)現(xiàn)κ-CN基因型對產(chǎn)奶量和乳蛋白率都有顯著影響,BB型比AA型產(chǎn)奶量少173 kg,但乳蛋白率比AA型高0.08%,而且CSN3對乳脂率的影響不顯著,但影響乳脂量。Alipanah等[18]在俄羅斯牛種中發(fā)現(xiàn)κ-CN BB型比AA型和AB型有更高的乳蛋白率,并指出將CSN3作為遺傳標記納入選種方案可以顯著地改善牛群的乳品特征。Rachagani等[19]對 252頭印度Sahiwal牛的研究表明,κ-CN BB型有更高的產(chǎn)奶量、非脂肪固形物產(chǎn)量和乳蛋白量。鞠志花[20]等結合測序結果采用PCR-RFLP檢測了CSN3的多態(tài)性,提出在中國荷斯坦奶牛群體中,κ-CN B等位基因可作為改良奶牛乳脂率性狀的分子遺傳標記。本文作者用酶切軟件分析了GenBank中具有代表性的兩條序列AY380228(A等位基因)和 AY380229(B等位基因),發(fā)現(xiàn)TaqⅠ是針對引起136位氨基酸變異的核苷酸突變的,HidⅢ和HinfⅠ是針對引起148位氨基酸變異的核苷酸突變的,而PstⅠ是針對編碼168位Ala的核苷酸同義突變位點;并且發(fā)現(xiàn)3個位點的酶切多態(tài)性是緊密連鎖的。因此,各研究擴增片段和所用酶雖不盡相同,但并不影響基因型的判斷。Tsiaras[21]等研究結果顯示,AB型κ-CN在奶蛋白產(chǎn)量和含量上顯著地高于AA型,而且AB型有更高的產(chǎn)奶量和乳脂量;但是κ-CN對繁殖性能并沒有影響。由此在品種的選育過程中,可選擇對產(chǎn)奶性狀有利的乳蛋白類型,且不會對乳牛的生產(chǎn)繁殖性能產(chǎn)生負面影響。

表2 牛κ酪蛋白基因分型及與泌乳性狀的關聯(lián)研究

關于κ酪蛋白對奶酪生產(chǎn)方面影響的報道也較多。Marziali[22]等報道BB型κ-CN乳樣中的總固型物質、脂肪和蛋白質含量最高,是生產(chǎn)奶酪的最理想原料。Eenennaam[23]等通過凝乳酶水解、PAGE檢測以及光密度掃描等方法巧妙地揭示出在AB型雜合體牛中,B等位基因κ酪蛋白比A等位基因κ酪蛋白在乳樣中的含量更高,即表明B等位基因可提高乳中κ-CN的表達。Wedholm等[24]分析顯示凝固性差的和不凝固的乳樣都與低濃度的κ-CN及其在總酪蛋白中所占的比率低有關。還有,AB型κ-CN牛的乳樣比AA型的有更高的κ-CN濃度,而AB和AE型以及AA和AE型之間則無顯著差異。此外,他們還提出,酪蛋白在乳蛋白中的高比率顯著地有利于蛋白質到奶酪的轉化?？傊?眾多研究表明,BB型κ-CN牛乳不僅凝乳時間短,凝塊硬度大,而且奶酪產(chǎn)量高,極其適合制作奶酪。

4 κ酪蛋白基因影響奶牛性狀表現(xiàn)的可能機制

乳蛋白變異體之間理化性質上的差異可能是由其蛋白質組成所引起的,而蛋白質組成的不同又是由編碼序列的多態(tài)性決定的。Plowman等[25]研究了含有κ-CN C變異體的牛乳比含有A和B變異體的牛乳凝乳時間更長的原因,認為是κ-CN C變異體第97位氨基酸His改變了其空間構象,從而使它與凝乳酶的結合不緊密,所以凝乳酶對其切割比較緩慢。κ-CN A和B變異體之間對奶酪生產(chǎn)的影響機理也可能與此類似。

κ酪蛋白基因型與泌乳性狀間的關聯(lián)性可以用基因調(diào)控區(qū)存在突變位點來解釋。Schild等[26]分析了7個牛種13頭奶牛CSN 3 5′側翼區(qū)約1 kb的序列,發(fā)現(xiàn)15個單核苷酸替換,有一些位于幾個可能的調(diào)控蛋白,如 MGF(Mammary Gland Factor)、HNF3(Hepatocyte Nuclear Factor 3)、GR(Glucocorticoid Receptor)、OCT1(Octamer Binding Factor l)、PMF(Pregnancy-specific Mammary Nuclear Factor)、AP2(Activator Protein-2)等的結合位點,認為這正是基因表達有差異的原因。除5′側翼區(qū)外,3′非編碼區(qū)也可能影響基因的表達。Debeljak等[27]通過RT-PCR和毛細管電泳定量顯示κ-CN AB雜合體中 B轉錄本比A轉錄本多 13.4%。并且在CSN3的3′-UT R發(fā)現(xiàn)有7個多態(tài)位點,其中2個接近加尾信號序列,可能在決定polyA尾的長度中起重要作用,而polyA尾長度又會影響mRNA的穩(wěn)定性。Robitaille等[28]依據(jù)κ-CN B等位基因mRNA在κ-CN總mRNA中所占的比率通過聚類分析將18頭奶牛分為兩組(組1為50±0.09,組2為56±1.3),然后將其與κ-CN B變異體蛋白質在κ-CN總蛋白中所占比率進行t檢驗,結果未發(fā)現(xiàn)它們之間有相關性。因此提出可能是κ-CN非編碼區(qū)存在等位基因多態(tài)位點,影響基因的轉錄活動、剪切過程及mRNA的穩(wěn)定性,從而間接影響κ-CN A、B兩個等位基因的表達。

后來,人們又將目光放在了啟動子區(qū)的轉錄因子結合位點(Transcription Factor Binding Sites,TFBS)。在理論上預測TFBS即可為以后的功能啟動子研究提供最初的定位,又可證實啟動子內(nèi)的功能元件是增強還是抑制基因表達。Malewski[29]指出κ-CN啟動子區(qū)包含以下轉錄因子:C/EBP(CCAAT/Enhancer Binding Protein)、CTF/NF1(CCAAT-Binding TranscriptionFactor/Nuclear Factor 1)、MAF(Mammary cell-Activating Factor)、MGF 、PMF 、YY1(Yin and Yang 1),它們中有的對轉錄起誘導作用,有的起抑制作用;有些是通用轉錄因子,有些是乳腺特異轉錄因子。Debeljak等[30]揭示出κ-CN啟動子近側750 bp區(qū) TFBS的密度比-1 300 bp～-750 bp區(qū)的低,后面區(qū)域內(nèi)反芻動物有3個均勻分布的信號傳導與轉錄活化因子5(Signal Transducers and Activators of Transcription 5,STAT5)。牛 CSN3的3個 STAT5位于-1 300 nt～-1 000 nt內(nèi),其實驗也證明2 064 bp長的κ-CN啟動子比925 bp長的轉錄效率更高。

也有學者探究了κ-CN啟動子區(qū)與編碼區(qū)之間單倍型的關系。Kaminski[31]研究證實κ-CN啟動子區(qū)與第4外顯子區(qū)存在基因內(nèi)單倍型,而且與乳蛋白率顯著相關。Keating等[32]研究了9個牛品種κ-CN的啟動子區(qū),發(fā)現(xiàn)有三個多態(tài)位點,-514,-426和-384(T/G,T/C和T/C),它們之間是連鎖的。同時他們也對κ-CN的第4外顯子進行了分型,并沒有發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)與編碼區(qū)存在明顯的連鎖。雖然這三個多態(tài)位點位于 TFBS內(nèi),但是它們對各項產(chǎn)奶指標均無影響。不過他們也并不排除κ-CN啟動子區(qū)單倍型與影響奶質的其他基因存在連鎖的可能性。

5 展望

許多研究成果表明κ-CN基因和與泌乳性能及乳成分之間存在一定的相關性,但是結果不盡一致,究其原因可能有以下幾點:①所研究的品種及其所處地域不同;②影響奶牛泌乳性狀的各基因之間存在連鎖,有些可能是κ-CN連鎖基因的效應而并非它本身的效應;③不同的調(diào)控元件變異體可與相同的表達蛋白變異體組成基因內(nèi)單倍型,光研究編碼區(qū)可能得不出正確結論;④所選擇統(tǒng)計模型的不同、樣本量差異等人為因素也影響結果。

基因表達受不同水平一系列復雜機制的控制,如基因激活及轉錄起始,mRNA加工與轉運,mRNA的穩(wěn)定性,mRNA的翻譯效率及翻譯后修飾等?；虮磉_主要在轉錄水平被調(diào)控,但現(xiàn)在對CSN3轉錄調(diào)控的研究還不夠充分,需繼續(xù)深入研究。此外,對CSN3的研究主要集中在第4外顯子區(qū),還需要對其它外顯子及內(nèi)含子甚至整個基因,特別是本文提到的幾處可能調(diào)控區(qū)進行深入分析,發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性并揭示它們與產(chǎn)奶性狀之間的關系。

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