異甘草酸鎂對慢性髓細胞性白血病K562細胞系增殖的抑制作用

遲小華，楊 波，張 峰，盧學春，劉麗宏，代漢仁（.解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥劑科，北京 00800；.解放軍總醫(yī)院南樓血液科，北京 0085；.中國科學院北京基因組研究所，北京 0009）

異甘草酸鎂（magnesium isoglycyrrhizinate）是天然甘草酸的立體異構體鎂鹽，具有抗炎、保護肝細胞膜、抗氧化等多種功效。肝臟是血液腫瘤放化療時最容易受到影響的器官，肝臟毒性也常常是限制放化療劑量和治療方案得以順利實施的重要因素。因此，對于血液腫瘤患者化放療期間加強保肝治療非常必要。然而，在白血病化療期間應用異甘草酸鎂保肝治療的同時是否對白血病細胞也具有保護作用目前尚不清楚。有研究表明，甘草酸及其衍生物對多種類型的實體腫瘤細胞具有抑制增殖和促進凋亡的作用，還可能具有逆轉腫瘤化療耐藥的作用[1-3]。目前，有關異甘草酸鎂對白血病細胞生物學特性的影響尚未見報道。本研究通過將不同濃度的異甘草酸鎂作用于人慢性髓細胞白血病K562細胞系，觀察其對白血病細胞增殖的抑制作用，為臨床治療白血病合并肝損傷提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

自動酶標儀（CHROMATE4300酶標儀，陜西展鵬科技有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（RCO-3000TVBB型，美國RECO）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；細胞培養(yǎng)瓶（加拿大BIOFIL公司）；96孔板（上海Sunub科技發(fā)展公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；微量移液器（法國Pipetman公司）；電子天平（德國賽多利斯）。

異甘草酸鎂（正大天晴制藥有限公司，純度98.5%，批號091231）：粉狀白色結晶。RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；10%胎牛血清（杭州四季青公司）；CCK-8檢測試劑盒（上海日本同仁化學研究所）。

1.2 細胞

人慢性髓細胞白血病K562細胞株由解放軍總醫(yī)院基礎所免疫室韓為東博士惠贈。

1.3 K562細胞培養(yǎng)

將K562細胞置于含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～4 d換液傳代1次。

1.4 CCK-8法測定

取對數生長期細胞，調整細胞數為1×105～1×106·mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，12 h后加入異甘草酸鎂，實驗組異甘草酸鎂采用無血清1640培養(yǎng)液稀釋，貯存濃度為20 g·L-1，終稀釋濃度分別為10，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6g·L-1；對照組加與最高濃度組等量的RPMI 1640培養(yǎng)液，每組設3個重復孔，分別孵育24，48，72 h。顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，并攝像。實驗結束，每孔加入5 mg·mL-1的CCK-8 10 μL，繼續(xù)孵育2 h，置酶標儀上用450 nm和630 nm雙波長測吸光度值（OD值）。檢測的 OD值大小與活細胞數目呈正相關，以OD值為縱軸，作用時間為橫軸，繪制細胞增殖曲線。取24 h的OD值比較各組的細胞增殖抑制率，實驗重復3次。計算公式如下：

細胞增殖抑制率（%） = （1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 鏡下觀察異甘草酸鎂對K562細胞的抑制作用

藥物處理第1～3天后，鏡下觀察10 g·L-1給藥組細胞生長明顯受抑，細胞數量減少；其余各藥物濃度組細胞生長狀態(tài)與對照組無明顯差異（圖1）。

圖1 不同濃度異甘草酸鎂作用下培養(yǎng)48 h K562細胞生長狀態(tài)①對照組；②10 g·L-1組；③1 g·L-1組；④1×10-1 g·L-1組；⑤1×10-2 g·L-1組；⑥1×10-3 g·L-1組；⑦1×10-4 g·L-1組；⑧1×10-5 g·L-1組；⑨1×10-6 g·L-1組Fig 1 Microscopic observation of K562 cell growth 48 hours after treatment with different concentrations magnesium isoglycyrrhizinate①the control group; ②10 g·L-1 group; ③1 g·L-1 group; ④1×10-1 g·L-1 group; ⑤1×10-2 g·L-1 group; ⑥1×10-3 g·L-1 group; ⑦1×10-4 g·L-1 group; ⑧1×10-5 g·L-1 group; ⑨1×10-6 g·L-1 group

2.2 異甘草酸鎂抑制K562細胞增殖的生長曲線及抑制率

不同濃度的異甘草酸鎂作用于K562細胞后，對細胞的生長有明顯的抑制作用，并且具有時間和濃度依賴性。接種后的細胞在48 h處于對數生長期，10 g·L-1藥物濃度作用24，48和72 h后細胞生長抑制率分別為44.9%，65.9%，86.4%。異甘草酸鎂作用48 h后IC50約為1.6 g·L-1（見圖2、表1）。

圖2 不同濃度異甘草酸鎂作用K562細胞生長曲線Fig 2 Growth curves of K562 cells after treatment with magnesium isoglycyrrhizinate at different concentrations

3 討論

異甘草酸鎂是從甘草中提取的甘草酸堿催化異構化后成鹽精制而得。研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸通過作用于激素受體，影響離子通道等機制，不但具有類腎上腺皮質激素樣作用，還具有抗炎、減輕免疫病理反應的作用，臨床上已用于治療藥物性和病毒性肝炎[4-8]。對于血液腫瘤患者而言，化放療期間同時加強保肝治療已成為降低化放療相關肝毒性的重要策略。異甘草酸鎂在保護肝細胞的同時是否對白血病細胞的增殖也具有促進作用尚不明確。

表1 異甘草酸鎂作用K562細胞48 h的生長抑制率.n = 3Tab 1 Inhibitory rate of K562 cells 48 hours after treatment with magnesium isoglycyrrhizinate.n = 3

本研究結果表明，異甘草酸鎂對人慢性髓細胞白血病K562細胞系的增殖具有抑制作用；在濃度為10-2g·L-1以上時抑制作用更顯著（抑制率＞ 30%），并呈劑量、時間依賴性；48 h的半數抑制濃度為1.6 g·L-1，這與文獻報道的甘草酸及其類似物（甘草黃酮、甘草次酸）在較高濃度時才具有顯著抑瘤作用的結果類似[9-10]。以異甘草酸鎂臨床常用劑量計算，體內藥效學濃度與體外抑制白血病細胞增殖的濃度相近（1×10-3～1×10-2g·L-1），而此劑量范圍對于正常造血功能恢復無影響。此外，我們利用生物信息學方法分析了異甘草酸鎂對人類基因表達譜的影響，發(fā)現(xiàn)上調基因7條，下調基因22條（數據尚未發(fā)表），并初步預測出異甘草酸鎂可能具有去乙?；D移酶抑制劑曲古抑菌素樣的作用，這有可能是它抑制白血病細胞增殖的分子機制。本研究為異甘草酸鎂預防和治療白血病化療相關肝損傷提供了實驗依據。異甘草酸鎂抗白血病的確切機制以及是否與化療藥物具有協(xié)同抗白血病作用仍有待于深入研究。

[1] Wakamatsu T, Nakahashi Y, Hachimine D,et al.The combination of glycyrrhizin and lamivudine can reverse the cisplatin resistance in hepatocellular carcinoma cells through inhibition of multidrug resistance-associated proteins[J].Int J Oncol, 2007, 31(6): 1465-1472.

[2] 陶文沂，聶小華，尹光耀，等.甘草有效成分體外抗腫瘤活性和免疫活性的研究[J].中藥材，2003，26（7）：507-509.

[3] Hawthorne S, Gallagher S.Effects of glycyrrhetinic acid and liquorice extract on cell proliferation and prostate-specific antigen secretion in LNCaP prostate cancer cells[J].J Pharm Pharmacol,2008, 60(5): 661-666.

[4] 胡繼偉，楊俊霞，許青田，等.異甘草酸鎂與甘草酸二銨治療慢性乙型肝炎臨床療效對比研究[J].中外健康文摘，2007，4（5）：480-481.

[5] 曾春香，楊晴，胡琴.異甘草酸鎂與復方甘草酸苷在大鼠體內分布和代謝的比較研究[J].中國藥房，2006，17（20）：1543-1545.

[6] 王佩，吳錫銘.異甘草酸鎂對大鼠四氯化碳慢性肝損傷的治療作用[J].中國新藥與臨床雜志，2004，23（12）：833-836.

[7] 張慶娟，黃維.異甘草酸鎂治療病毒性肝炎的療效觀察[J].臨床與實驗醫(yī)學雜志，2007，6（6）：86.

[8] 李昌平，劉厚鈺.強力寧對慢性肝炎患者IL-6及TNF-α的影響[J].中華傳染病雜志，1997，15（3）：156-157.

[9] 劉強，陳興興，孫學剛，等.甘草黃酮對荷瘤（S180）小鼠免疫細胞數量的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（12）：904-906.

[10] 黃煒，黃濟群，張東方，等.維甲酸、甘草酸和18β-甘草次酸抗人肺癌細胞增殖和侵襲的作用[J].中國腫瘤，2003，12（11）：665-667.