受PVY誘導(dǎo)的煙草NtERD1的基因分離與表達(dá)分析

陳 帥，劉貫山，楊?lèi)?ài)國(guó)，王元英，孫玉合

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草類(lèi)作物質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

煙草（Nicotiana tabacumL.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有很重要的地位。煙草的田間種植經(jīng)常受到馬鈴薯Y病毒（PVY）等多種病原菌的侵染且危害程度越來(lái)越重，嚴(yán)重影響煙草種植和煙葉生產(chǎn)[1]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，為最大限度地減輕病害脅迫造成的傷害，形成了一系列復(fù)雜的機(jī)制，期間會(huì)引發(fā)和激活上千種基因的表達(dá)[2]。

快速應(yīng)答在植物應(yīng)對(duì)外界環(huán)境生物脅迫和非生物脅迫中起到重要作用，是植物一種積極有效的反應(yīng)。脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因（ERD）是可以快速應(yīng)答干旱反應(yīng)的基因，最早是在擬南芥脫水誘導(dǎo)1 h獲得的[3]。目前在擬南芥中已獲得16個(gè)ERD基因，它們屬于不同的基因家族，作用于不同的代謝途徑，通過(guò)不同的方式增強(qiáng)擬南芥的抗旱性；除了具有快速應(yīng)答干旱脅迫的特征，還具有應(yīng)答冷、鹽、衰老、ABA等多種逆境脅迫信號(hào)的特征[4]。其中ERD15是受干旱誘導(dǎo)快速應(yīng)答的基因，編碼1個(gè)親水性蛋白[5-6]，該基因受干旱、高鹽、低溫、外界損傷、ABA、水楊酸、植物病原菌等多種生物脅迫和非生物脅迫的刺激誘導(dǎo)快速表達(dá)[7]。

目前生產(chǎn)上對(duì)于煙草 PVY的防治尚無(wú)有效的藥劑，所以篩選相關(guān) PVY抗性基因，從而選育抗PVY煙草品種在該病害的綜合治理中顯得尤為重要。本研究通過(guò)抑制差減雜交和cDNA芯片從煙草抑制差減雜交文庫(kù)中篩選得到一個(gè)脫水誘導(dǎo)蛋白基因。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析該基因在PVY不同誘導(dǎo)時(shí)期的表達(dá)模式，揭示其在不同誘導(dǎo)時(shí)期的表達(dá)量以及對(duì) PVY誘導(dǎo)的應(yīng)答機(jī)制，以期為利用該基因改良普通煙草的抗 PVY能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試材料為高抗PVY的白肋煙VAM。將種子播種于消毒的土壤和播種盤(pán)中，置于溫室自然光照條件下培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至 4～5片真葉時(shí)，采用摩擦法[8]進(jìn)行 PVY接種（10倍接種液）處理，分別收集接種處理及未接種對(duì)照（空白接種液處理）在12 h、24 h、2 d、3 d、5 d和8 d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的葉片組織。所有實(shí)驗(yàn)材料凍存于-70℃冰箱中備用。

1.2 總RNA提取與mRNA分離純化

取接種處理及未接種對(duì)照在6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的葉片各1 g，在液氮中速凍研磨。采用Trizol法提取葉片總RNA，提取步驟參照RNApure超純總RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（蓋寧生物）。將提取的RNA溶解后置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。將接種處理和未接種對(duì)照的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總RNA等量混合，形成500 μg的總RNA池，用于mRNA的分離。mRNA的分離純化參照PolyA Tract mRNA Isolation Systerms試劑盒（Promaga公司）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，分離純化mRNA的量為2 μg。

1.3 篩選PVY誘導(dǎo)表達(dá)的EST序列

抑制差減雜交方法的具體操作按照CLONTECH PCR-SelectTM cDNA Subtraction kit試劑盒（Clontech公司）使用手冊(cè)進(jìn)行。取適量純化的抑制差減雜交產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、構(gòu)建抑制差減雜交文庫(kù)。從該文庫(kù)中挑取陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化濃縮，點(diǎn)制cDNA芯片。根據(jù)6個(gè)不同的接種時(shí)間點(diǎn)，制備6張cDNA芯片，分別反映不同接種時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)情況。以Cy5標(biāo)記接種PVY的煙草葉片mRNA（處理），Cy3標(biāo)記未接種PVY的煙草葉片mRNA（對(duì)照）作為探針?lè)謩e與6張芯片雜交，每張芯片反映的是處理與對(duì)照兩個(gè)樣品的比較結(jié)果，以?xún)蓚€(gè)樣品的比值Ratio值作為差異表達(dá)的參考值。Ratio值≥2或≤0.5的表示表達(dá)有差異的基因；Ratio值在0.5～2之間的屬于表達(dá)基本沒(méi)有差異的基因。對(duì)所獲得上調(diào)表達(dá)克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)所獲得的ESTs序列信息在NCBI的Blast（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析，從差異表達(dá)片段中挑取脫水誘導(dǎo)基因的EST序列。

1.4 序列分析

利用NCBI的ORfinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預(yù)測(cè)該序列的開(kāi)放閱讀框，通過(guò)NCBI網(wǎng)站的Blast程序進(jìn)行核苷酸序列與氨基酸序列的同源性比對(duì)。采用DNAMAN（6.0版）預(yù)測(cè)編碼產(chǎn)物的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量和等電點(diǎn)。應(yīng)用DNAStar Protean軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用ClustalX（1.83版）對(duì)NtERD1與擬南芥的16個(gè)ERD編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，并通過(guò) MEGA4.0軟件[9]構(gòu)建鄰接法 NJ（neighbor joining）系統(tǒng)樹(shù)[10]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

分別取不同接種時(shí)間點(diǎn)和空白接種對(duì)照的葉片組織總RNA 3 μg為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA的合成按照PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）的說(shuō)明書(shū)操作。對(duì)實(shí)驗(yàn)中不同處理的cDNA模板進(jìn)行 10倍梯度稀釋?zhuān)謩e對(duì)內(nèi)參基因Actin和目的基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，縱坐標(biāo)為臨界循環(huán)值Ct，橫坐標(biāo)為稀釋濃度的對(duì)數(shù)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的線(xiàn)性計(jì)算公式[11]得到目的基因相對(duì)濃度。

利用熒光染料法進(jìn)行相對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)，以煙草Actin基因（NTU60495）為內(nèi)參，采用25 ul PCR體系，包括12.5 ul SYBR Green Master mix reagent、10 ul無(wú)菌水、0.5 ul DyeⅡ、1 ul cDNA和各0.5 ul（2 mM）的熒光定量上、下游引物（RTF:5'- CAC TGA TAA GAA CTA TGC GTT CAC -3';RTR: 5'- CTA AGC TAA TCA CAT TCA GCG AG -3';ActinF: 5'-CAA GGA AAT CAC CGC TTT GG-3';ActinR: 5'-AAG GGA TGC GAG GAT GGA-3'）。PCR 程序?yàn)?95℃ 1 min，（95℃ 6s，62℃ 35 s）×35個(gè)循環(huán)。操作步驟參照 SYBR?Premix Ex Taq?（Perfect Real Time）（TakaRa公司）的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。通過(guò)ABI 7500 Fast Real-Time PCR System的SDSShell.exe分析系統(tǒng)分析NtERD1的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 煙草脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因的篩選及序列分析

以6個(gè)不同PVY接種時(shí)期的煙草葉片mRNA作為探針，利用cDNA芯片篩選已構(gòu)建的抑制差減雜交文庫(kù)。cDNA芯片分析結(jié)果顯示，共有915個(gè)上調(diào)表達(dá)的克?。≧atio值＞2）（cDNA芯片結(jié)果未顯示），挑選部分上調(diào)表達(dá)的克隆進(jìn)行測(cè)序。克隆序列經(jīng)在NCBI網(wǎng)站比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，其中一條745 bp的EST序列與番茄（Lycopersicon esculentum）脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因ERD15（GenBank登錄號(hào)AF261139）高度同源。ORfinder分析結(jié)果顯示，該序列包含一個(gè)492 bp的開(kāi)放讀碼框，編碼163個(gè)氨基酸（圖1）。氨基酸Blastp比對(duì)顯示，該氨基酸序列與其他植物脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答蛋白具有很高的同源性，與番茄ERD15（AAF75749）同源性為85%，與辣椒（Capsicum annuum）ERD15（ABB89735）同源性為74%，因此，該EST序列為煙草脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因，被命名為NtERD1（Nicotiana tabacum early responsive to dehydration 1），GenBank登錄號(hào)為GU144573。

注：核苷酸和氨基酸序數(shù)在左邊用數(shù)字標(biāo)出，起始密碼子和終止密碼子加框標(biāo)出。

DNAMAN（6.0版）分析一級(jí)結(jié)構(gòu)表明，NtERD1編碼的氨基酸分子量為 18.4 kD，等電點(diǎn)（pI）為4.36。應(yīng)用DNAStar Protean軟件的Garnier法進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，NtERD1屬于一種混合型蛋白，在二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α螺旋占7.98%，β片層占54%，Turn轉(zhuǎn)角占19%，Coil無(wú)規(guī)則卷曲占19%。

2.2 NtERD1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

目前在植物中獲得具有ERD特征的基因較少，研究報(bào)道主要集中在擬南芥上，功能研究較全面，因此本文利用MEGA4.0軟件對(duì)煙草NtERD1和16個(gè)擬南芥ERD蛋白構(gòu)建鄰接法NJ系統(tǒng)樹(shù)（圖2）。進(jìn)化分析表明，NtERD1與AtERD15進(jìn)化關(guān)系較近，它們可能是直系同源蛋白。

2.3 NtERD1熒光定量表達(dá)分析

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)NtERD1在空白接種對(duì)照及接種處理的表達(dá)特性進(jìn)行分析。融解曲線(xiàn)分析表明，內(nèi)參基因Actin（圖3a）和目的基因NtERD1（圖3b）的擴(kuò)增產(chǎn)物均呈較為銳利的單一峰，Tm分別為83℃和84.5℃左右。將反轉(zhuǎn)錄得到的煙草葉片cDNA模板按照50、5-1、5-2、5-3和5-4濃度進(jìn)行稀釋?zhuān)韵♂対舛鹊膶?duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以臨界循環(huán)值為縱坐標(biāo)分別對(duì)內(nèi)參基因和目的基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作。以普通煙草Actin基因設(shè)計(jì)的ActinF和ActinR為熒光定量PCR反應(yīng)引物，按熒光定量反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，構(gòu)建內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，R2=0.998297，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率為-3.538515，截距為31.255245，直線(xiàn)方程為Y= -3.538515X+31.255245（圖4a）；以普通煙草目的基因設(shè)計(jì)的RTF和RTR為熒光定量 PCR反應(yīng)引物，構(gòu)建目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，R2=0.992372，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率為-4.266456，截距為 30.819479，直線(xiàn)方程為Y= -4.266456X+30.819479（圖4b）。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析表明，內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍較廣，在5個(gè)數(shù)量梯度上呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖2 NtERD1與擬南芥16個(gè)ERD的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relatedness among NtERD1 and 16 ERDs from Arabidopsis thaliana

圖3 內(nèi)參基因(a)和目的基因(b)擴(kuò)增的熔解曲線(xiàn)Fig.3 Melting curves of the endogenous control and test gene

圖4 內(nèi)參基因(a)和目的基因(b)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 Standard curves of the endogenous control and test gene

在檢測(cè)的線(xiàn)性范圍分別收集12 h、24 h、2 d、3 d、5 d和8 d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種PVY和空白接種對(duì)照（CK）的煙草葉片組織并提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR表達(dá)分析結(jié)果顯示，NtERD1在PVY接種早期上調(diào)表達(dá)，接種PVY后12 h、1 d、2 d和3 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)與空白接種對(duì)照相比表達(dá)量明顯增高，與對(duì)照相比分別增高了11%、61.6%、35.7%和76.3%，隨后表達(dá)量逐漸降低（圖5）。

圖5 NtERD1在不同時(shí)間點(diǎn)接種PVY的表達(dá)量Fig.5 The expression patterns of NtERD1 induced by PVY at different time stages.

3 討 論

通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，可以分析分子之間的起源關(guān)系，預(yù)測(cè)分子的功能；同一亞家族或分枝往往具有相似的功能。研究表明，同源關(guān)系較近的基因往往編碼同類(lèi)蛋白，表現(xiàn)出極為相似的功能。例如擬南芥AtERD10和AtERD14，它們的編碼產(chǎn)物屬于Ⅱ型LEA蛋白家族(胚胎晚期豐富蛋白)，干旱處理1 h后在擬南芥的葉片組織強(qiáng)烈表達(dá)，基因的表達(dá)同時(shí)還受ABA的誘導(dǎo)，不受低溫、2，4-D、BA和GA3等其他激素的誘導(dǎo)[12]。AtERD11和AtERD13的編碼產(chǎn)物屬于硫代谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，有可能在植物脫水中避免毒素的產(chǎn)生[13]。與NtERD1同源關(guān)系較近的AtERD15受多種生物因子和非生物因子的誘導(dǎo)快速表達(dá)。過(guò)表達(dá)ERD15會(huì)降低植株對(duì)干旱、冷和ABA等脅迫的耐受力；相反，缺失ERD15的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性和抗冷性都提高；過(guò)表達(dá)ERD15也伴隨著ABA的含量增加，植株對(duì)ABA的敏感性降低；過(guò)表達(dá)ERD15誘導(dǎo)了受水楊酸調(diào)控基因的應(yīng)答，可以抵抗病原菌[7]。因此，NtERD1也可能具有與AtERD15相似的功能。

依賴(lài)ABA途徑的脫水反應(yīng)中，植物在脫水等脅迫條件下內(nèi)源 ABA水平會(huì)顯著增加，脅迫信號(hào)首先激發(fā)ABA合成酶的作用，使ABA在細(xì)胞內(nèi)迅速積累，然后內(nèi)源ABA通過(guò)ABA受體被細(xì)胞感知，從而觸發(fā)第二信號(hào)傳遞系統(tǒng)，植物做出相應(yīng)的抵御脅迫的反應(yīng)[14]。與 NtERD1位于同一進(jìn)化組中的AtERD15可能是一個(gè)新的與ABA信號(hào)脅迫相關(guān)的調(diào)節(jié)器。不依賴(lài) ABA途徑的植物脫水誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白，目前已鑒定出參與轉(zhuǎn)錄調(diào)解的順式作用元件和反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子），即順式作用元件DRE(dehydration responsive element)和含有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域的 DRE轉(zhuǎn)錄因子 CBF1、DREB1和DREB2[15-16]。擬南芥DEAR1編碼的蛋白包含DREB1/CBF結(jié)構(gòu)域和EAR基序。試驗(yàn)研究表明，DEAR1在轉(zhuǎn)錄水平上受病原菌侵染和低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[17]。

到目前為止，已有研究表明，植物脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因參與植物體抵御多種病原菌侵染的應(yīng)激反應(yīng)，受真菌、細(xì)菌、病毒等病原菌的誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)獲得的煙草脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因NtERD1是利用cDNA芯片篩選受PVY誘導(dǎo)的抑制差減文庫(kù)得到的表達(dá)上調(diào)基因，為進(jìn)一步驗(yàn)證NtERD1是否受PVY侵染的誘導(dǎo)，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究了不同接種時(shí)期NtERD1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量變化。結(jié)果表明，NtERD1在接種PVY 12 h、1 d、2 d和3 d時(shí)間點(diǎn)的煙草葉片組織中的表達(dá)量與空白接種對(duì)照的相比明顯增高，隨后逐漸降低。這表明，在PVY接種初期，NtERD1受PVY侵染早期的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，可能參與煙草早期的抗病毒反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本研究利用抑制差減雜交法和cDNA芯片法從受 PVY誘導(dǎo)的煙草抑制差減文庫(kù)中篩選得到一個(gè)受 PVY誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因NtERD1。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，NtERD1與擬南芥AtERD15可能是直系同源基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析進(jìn)一步證實(shí)，該基因是一個(gè)受 PVY侵染早期誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因。因此可以推斷，NtERD1可能在調(diào)控?zé)煵菘共《厩秩局衅鹬匾饔谩?/p>

[1]朱賢朝，王彥亭，王智發(fā).中國(guó)煙草病害[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：209-212.

[2]Seki M, Narusaka M, Ishida J, et al.Monitoring the expression profiles of 7000Arabidopsisgenes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length cDNA microarray[J].Plant J, 2002, 31(3):279-292.

[3]Kiyosue T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.Characterization of cDNA for a dehydration-inducible gene that encodes a ClP A, B-like protein inArabidopsis thalianaL[J].Biochem Biophys Res Commun, 1993,196(3): 1214-1220.

[4]劉穎慧, 王天宇, 黎裕.擬南芥脫水誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，14（3）：7-11.

[5]Kiyosue T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.Cloning of cDNA for genes that are early responsive to dehydration stress (ERDs) inArabidopsis thalianaL.:identification of three ERDs as HSP cognate genes[J].Plant Mol Biol, 1994, 25(5): 791-798.

[6]Kiyosue T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.ERD15, a cDNA for a dehydration-induced gene fromArabidopsis thaliana[J].Plant Physiol, 1994, 106: 1707.

[7]Kariola T, Brader G, Helenius E, et al.Early responsive to dehydration 15, a negative regulator of abscisic acid responses inArabidopsis[J].Plant Physiol, 2006, 142(4):1559-1573.

[8]竺曉平，朱常香，宋云枝，等.CP基因3'端短片段介導(dǎo)的對(duì)馬鈴薯Y病毒的抗性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（6）：1153-1158.

[9]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al.MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0[J].Mol Biol Evol, 2007, 24(8): 1596-1599.

[10]Saitou N, Nei M.The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Mol Biol Evol, 1987, 4(4): 406-425.

[11]Pfaffl M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nucl Acids Res,2001, 29(9): 2002-2007.

[12]Kiyosue T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.Characterization of two cDNAs (ERD10 and ERD14)corresponding to genes that respond rapidly to dehydration stress inArabidopsis thaliana[J].Plant Cell Physiol, 1994, 35: 225-231.

[13]Kyiosue T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.Characterization of two cDNAs (ERD11 and ERD13) for dehydration-inducible genes that encode putative glutathione S-transferases inArabidapsis thalianaL[J].FEBS Lett, 1993, 335: 189-192.

[14]沈元月，黃叢林，張秀海，等.植物抗旱的分子機(jī)制研究[J].中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，10（1）：30-34.

[15]Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, et al.Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, inArabidopsia[J].Plant Cell, 1998, 10(8): 1391-1406.

[16]Stockinger E J, Gilmour S J, Thomashow M F.Arabidopsis thalianaCBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 1035-1040.

[17]Tsutsui T, Kato W, Asada Y, et al.DEAR1, a transcriptional repressor of DREB protein that mediates plant defense and freezing stress responses inArabidopsis[J].J Plant Res, 2009, 122(6): 633-643.