茉莉酸甲酯對(duì)煙草α-淀粉酶抑制劑的誘導(dǎo)作用

徐佩佩，程新勝

（1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥 230052；2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230039）

α-淀粉酶抑制劑（а-amylase inhibitor,αAI）是一種熱穩(wěn)定性的糖蛋白[1]，近年來(lái)，不少研究表明它對(duì)植物抵御昆蟲(chóng)傷害有重要作用[2]。一般認(rèn)為其抗蟲(chóng)作用機(jī)制是與昆蟲(chóng)體內(nèi)的淀粉酶以1:1的分子比例結(jié)合形成穩(wěn)定的酶-抑制劑復(fù)合物(EI)，從而抑制淀粉酶活性，使昆蟲(chóng)攝取的食物中淀粉類物質(zhì)無(wú)法水解、消化，導(dǎo)致昆蟲(chóng)能量來(lái)源減少；同時(shí)，EI復(fù)合物還刺激昆蟲(chóng)的消化腺過(guò)量分泌消化酶，通過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)的反饋，使昆蟲(chóng)產(chǎn)生厭食反應(yīng)，影響其正常取食，令其生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，甚至導(dǎo)致死亡[1-3]。

茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。自Farmer和Ryan報(bào)道外源MeJA能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗蟲(chóng)性后，MeJA的這種生物學(xué)功能受到廣泛關(guān)注[4]，現(xiàn)已證實(shí)，MeJA誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的抗性作用是通過(guò)茉莉酸(JA)信號(hào)分子的傳導(dǎo)，激發(fā)植物形成防御反應(yīng)，過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)、多酚氧化酶 (Polyphenoloxidase,PPO)活性增加，形成特異性胰蛋白酶抑制劑(Trypsin proteinase inhabitor,TrypPI) 和胰凝乳蛋白酶抑制劑(Chrymoltrypsin proteinase inhibitor ChymPI),一些內(nèi)源抗生性物質(zhì)含量增加（如煙堿），從而提高植物自身的抗蟲(chóng)性[5]。Carla Sanchez-Hernandez報(bào)道外源的MeJA和脫落酸(Abscisic acid)處理千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)，可誘導(dǎo)其葉片中TrypPI和αAI含量增加，但高溫、干旱或鹽害等非生物脅迫(Abiotic Stress)則沒(méi)有這種誘導(dǎo)效應(yīng)[6]；進(jìn)一步的試驗(yàn)證明，MeJA誘抗處理后，αAI的表達(dá)與 29 kDa TrypPI的表達(dá)情況很相似；在番茄(Lycopersicon esculentum)和馬鈴薯(Solanum tuberosum)中也存在類似的情況，表明 MeJA誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶抑制劑可能有著相似的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。席征等對(duì) MeJA處理后煙草中 POD,PPO,TrypPI,ChymPI以及對(duì)斜紋夜蛾(Spodoptera lituraF.)生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，但未見(jiàn)MeJA誘導(dǎo)煙草αAI的表達(dá)特性和生物學(xué)效應(yīng)方面的報(bào)道[7]。本實(shí)驗(yàn)以煙草普通商業(yè)品種為供試材料，研究了MeJA誘導(dǎo)處理煙草葉片中αAI表達(dá)的時(shí)間及濃度效應(yīng)，同時(shí)就MeJA處理后的煙草葉片對(duì)斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙草 普通煙草栽培品種 K326（Nicotiana tabacumL.CV.K326），煙草種子在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培育發(fā)芽，待生長(zhǎng)至四葉期，移栽至裝有蛭石的塑料盆缽中，在（25±3）℃的培養(yǎng)室中，每天 900 μmo1/(m2·s)光照12 h，并定期澆灌Hoagland及Snyder營(yíng)養(yǎng)液，待煙苗第6片葉平展后用于MeJA誘抗處理[8]。

1.1.2 斜紋夜蛾 人工飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度28 ℃，光照12 h，相對(duì)濕度70%，選擇生長(zhǎng)整齊一致的5齡幼蟲(chóng)用于試驗(yàn)。

1.1.3 試劑來(lái)源及配制 MeJA，英國(guó) Apex Organics公司；考馬斯亮藍(lán) G-250和淀粉，F(xiàn)luka公司(Buchs,Switzerland)；α-淀粉酶，美國(guó) Sigma公司；DNS試劑參照文獻(xiàn)[9]配制；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；麥芽糖，天津大茂化學(xué)試劑廠，分析純；試驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.1.4 儀器 TGL-20G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；756P紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；DIALAB ELx 800全自動(dòng)酶標(biāo)儀，奧地利Labexin公司。

1.2 試驗(yàn)處理

MeJA溶液的配置：用無(wú)水乙醇溶解MeJA，再用雙蒸水稀釋至所需濃度，控制乙醇的終濃度為0.9%。對(duì)照組（CK）為 0.9%的乙醇水稀釋液。用小型噴霧器在煙株上均勻地噴灑MeJA溶液，每株噴液量為20 mL，對(duì)照株則噴施等量0.9%的乙醇溶液。由于MeJA具有揮發(fā)性，所以將各處理組煙株放置于培養(yǎng)室不同隔間以避免處理間相互干擾。

1.2.1 MeJA的誘抗處理 將 MeJA分別配制成0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmo1/L 五種梯度濃度。隨機(jī)選取6組煙苗，每組6株，分別用對(duì)照液或5種不同濃度的MeJA進(jìn)行處理，在噴液后24，48，72 h剪下被處理煙株倒數(shù)第 3片葉（從上向下數(shù)），迅速用塑料樣品袋密封，置于 4 ℃的冰箱中保存，1周內(nèi)進(jìn)行生化分析。

1.2.2 斜紋夜蛾的處理 試驗(yàn)時(shí)首先讓試蟲(chóng)在塑料養(yǎng)蟲(chóng)缽(5 cm×10 cm×5 cm)中用未處理煙葉適應(yīng)性飼養(yǎng)24 h后饑餓12 h，轉(zhuǎn)入放置有不同處理煙葉的養(yǎng)蟲(chóng)缽內(nèi)，讓其取食24 h，用于測(cè)定中腸α-淀粉酶活性。

1.3 前處理和生化分析

1.3.1 煙草 αAI的提取與活性檢測(cè) 煙葉 αAI 提取參照Willdon DC等的方法，并略作改進(jìn)：采集不同處理的煙葉并除去主脈，稱重，按m/v=1:10加入 pH 7.8的 Tris-HCI緩沖液（內(nèi)含 0.1%的Tween20），冰浴中勻漿，勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中，在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min，上清液為待測(cè)液[10]。

αAI活性檢測(cè)采用Van Loon碘比色法：取磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）配置濃度為1 mg/mL的α-淀粉酶0.25 mL，加入待測(cè)液0.25 mL，37 ℃下反應(yīng)30 min，加入1%可溶性淀粉溶液1 mL，37 ℃恒溫反應(yīng) 15 min 后加碘顯色，對(duì)照中不加淀粉酶抑制劑待測(cè)液,代以等量的磷酸鹽緩沖液。在酶標(biāo)儀上于660 nm處測(cè)定吸光度值。根據(jù)吸光度的差異計(jì)算抑制劑的相對(duì)活性[11]。

αAI的抑制活性表示方法為αAI活性 = AE660-AI660

上式中：AE660為對(duì)照管在 660 nm的吸光值;AI660為加入淀粉酶抑制劑待測(cè)液后的樣品在 660 nm的吸光值。

1.3.2 斜紋夜蛾中腸 α-淀粉酶活性檢測(cè) 斜紋夜蛾的解剖及中腸 α-淀粉酶活性的測(cè)定分別參照文獻(xiàn)[9]和[12]。10頭5齡幼蟲(chóng)為1組，用天平分別測(cè)定其體質(zhì)量后，在冰盤(pán)上迅速解剖，用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH 6.0）沖去體液，取中腸，加5 mL預(yù)冷緩沖液在冰浴中勻漿，勻漿液在4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清液作為酶液。取2%淀粉0.2 mL、0.2 mol/L PBS （pH6.0）0.8 mL、酶液 80 μL，室溫下反應(yīng)10 min后，置于37 ℃水浴中60 min加1 mL DNS試劑終止反應(yīng)，然后在沸水浴中處理 5 min，于550 nm處測(cè)吸光值。用0.2 mol/L PBS（pH 6.0）80 μL代替酶液作為對(duì)照。

α-淀粉酶活性/(mg·g-1·min-1)=C×Vt/(W×Vs×t)

其中，C為麥芽糖含量（mg）；Vt為反應(yīng)所用淀粉酶原液體積（mL）；Vs為淀粉酶原液總體積（mL）；W為蟲(chóng)體質(zhì)量（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）。麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～2 mg區(qū)間內(nèi)獲得。

α-淀粉酶活性抑制率/%=(對(duì)照組α-淀粉酶活性-處理組 α-淀粉酶活性）×100/對(duì)照組 α-淀粉酶活性；

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan分析，比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 MeJA誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生α-AI的濃度與時(shí)間效應(yīng)

從圖1可以看出，除了圖1（b）中0.01 mmol/L外，其它各項(xiàng)處理皆與CK間存在顯著的差異，在3個(gè)不同的時(shí)間段，隨著 MeJA濃度的增加，αAI活性漸上升并在 4 mmol/L處理達(dá)到最高，10 mmol/L處理則有所下降。處理24 h后圖1（a），0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmol/L MeJA處理組αAI的活性分別是對(duì)照組的1.31倍、1.37倍、1.32倍、1.75倍和1.63倍，0.01,0.1,1.0,10.0 mmol/L 四個(gè)處理間差異不顯著，但0.01,0.1,1.0 mmol/L三處理與CK及4.0 mmol/L處理間的差異性顯著；處理48 h后圖1（b），0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmol/L MeJA 處理組αAI的活性分別是對(duì)照組的1.63倍、1.75倍、1.87倍、2.44倍和1.87倍，4.0 mmol/L與其它組處理間差異顯著；處理72 h后圖1（c），0.01,0.1,1.0,4.0,10.0 mmol/L MeJA處理組αAI的活性分別是對(duì)照組的1.38,1.49,1.75,1.81,1.76倍，0.01和0.1mmol/L處理組與4.0 mmol/L處理組間差異顯著。

圖1 不同處理各濃度MeJA誘導(dǎo)的煙草αAI活性Fig.1 Different concentrations of MeJA induced а-amylase inhibitor activity in tobacco leaves

圖2顯示了CK和5種濃度的MeJA處理在3個(gè)不同的時(shí)間段內(nèi)對(duì)煙葉αAI的誘導(dǎo)情況。就總體變化趨勢(shì)而言，各個(gè)濃度MeJA處理變化趨勢(shì)較一致：除對(duì)照外，5個(gè)濃度處理在24 h的活性較低，在48 h時(shí)達(dá)到最大值，隨著時(shí)間延長(zhǎng)到72 h后則有所下降。

2.2 斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性比較

分別將對(duì)照和0.1，1.0，10.0 mmol/L 三種濃度MeJA 處理24，48，72 h 后的煙葉放入對(duì)應(yīng)的養(yǎng)蟲(chóng)缽內(nèi)，讓斜紋夜蛾 5齡幼蟲(chóng)取食，后檢測(cè)各試蟲(chóng)體內(nèi)中腸α-淀粉酶活力，結(jié)果見(jiàn)表1。MeJA處理24 h的，取食不同濃度MeJA處理煙葉的斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性均小于對(duì)照，隨著MeJA的濃度從0.1 mmol/L增加到10.0 mmol/L，斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性逐漸降低，α-淀粉酶的抑制率隨MeJA濃度升高而增加；統(tǒng)計(jì)分析表明，所有MeJA處理與CK呈顯著性差異，處理組內(nèi)，1.0 mmol/L和10.0 mmol/L處理與0.1 mmol/L處理間差異顯著；處理48 h的，取食MeJA處理煙葉的斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性均小于對(duì)照，抑制率隨MeJA的濃度升高而上升，處理間差異顯著性與24 h的類似；取食MeJA處理72 h煙葉的斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶的活性也是處理組小于 CK，且差異顯著，處理組內(nèi)，10.0 mmol/L處理組中腸 α-淀粉酶活性小于 0.1 mmol/L和1.0 mmol/L處理，且差異顯著。

圖2 MeJA處理時(shí)間對(duì)煙草αAI的影響Fig.2 Different time treatment induced tobaccoа-AI activity

表1 取食不同濃度MeJA處理煙草斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶活性比較Table 1 Spodoptera litura (F.) midgut а-amylase activity after fed on different concentrations of MeJA treatment tobacco leaves

表1 取食不同濃度MeJA處理煙草斜紋夜蛾中腸α-淀粉酶活性比較Table 1 Spodoptera litura (F.) midgut а-amylase activity after fed on different concentrations of MeJA treatment tobacco leaves

注：數(shù)值后不同小寫(xiě)字母表示5%顯著差異。

處理時(shí)間/h CK酶活性 酶活性/(mg·g-1·min-1) 抑制率/% 酶活性/(mg·g-1·min-1) 抑制率/% 酶活性/(mg·g-1·min-1) 抑制率/%0.1 mmol/L 1.0 mmol/L 10.0 mmol/L 24 0.487±0.017 0.387±0.027 20.5 0.317±0.022 c 35.9 0.311±0.033 36.1 48 0.495±0.023 0.394±0.042 20.4 0.308±0.055 c 37.8 0.298±0.029 39.8 72 0.476±0.035 0.377±0.018 20.8 0.322±0.041 b 32.4 0.268±0.018 43.7

3 討 論

由昆蟲(chóng)取食所引發(fā)的植物防御反應(yīng)并非是單一途徑，它可能引起植物整個(gè)的代謝重組[13]。MeJA作為一種外源信號(hào)物質(zhì)處理植物后可以提高植物POD、PPO以及TrypPI和ChymPI的活性，增加內(nèi)源抗生性物質(zhì)含量（如丁布[14]、異硫氰酸鹽[15]、煙堿[16]）。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，在 MeJA處理煙草普通栽培品種K326的植株后，其POD，PPO，TrypPI，ChymPI亦增加；在取食MeJA處理的煙草葉片后，斜紋夜蛾幼蟲(chóng)相對(duì)生長(zhǎng)速率(RGR)降低[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MeJA處理可誘導(dǎo)煙草葉片 αAI活性增加，斜紋夜蛾取食后，中腸α-淀粉酶活性逐漸降低。MeJA的處理不僅可以使斜紋夜蛾幼蟲(chóng)對(duì)煙葉蛋白質(zhì)的吸收利用受到了抑制，而且對(duì)淀粉的分解吸收也受到抑制，可能正是這些多重作用導(dǎo)致了斜紋夜蛾幼蟲(chóng)RGR的降低。

Benjamin A Babst等[17]利用C11標(biāo)記研究JA處理美洲山楊(Populus tremuloides)后發(fā)現(xiàn)，JA處理可導(dǎo)致處理葉及系統(tǒng)葉片上淀粉類物質(zhì)向植株的根部和主莖移動(dòng)，葉片中淀粉含量降低，同時(shí)光合作用速率沒(méi)有改變。Jens Schwachtje指出，對(duì)野生煙草植株進(jìn)行模擬害蟲(chóng)取食處理后，蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶(SNF1)介導(dǎo)煙草植株將更多的碳水化合物貯存到根部組織中，使葉片組織中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量降低[18]，同時(shí)也為自身下一步的生長(zhǎng)貯存能量。對(duì)于已經(jīng)合成、沉積在葉片中的淀粉類物質(zhì)，植物通過(guò)增加葉片中αAI含量，來(lái)抑制害蟲(chóng)對(duì)淀粉類物質(zhì)的消化能力，減少其利用吸收，從而構(gòu)建更加全面的防御體系。

外源MeJA的濃度與其對(duì)煙草植株αAI的誘導(dǎo)作用僅在一定濃度范圍內(nèi)成正相關(guān)（圖1），這與前期MeJA處理對(duì)煙草TrypPI、ChymP誘導(dǎo)試驗(yàn)情況相似[7]，說(shuō)明MeJA對(duì)煙草的誘抗效應(yīng)與其施用劑量并不總是呈正相關(guān)，煙草只有在施用合適劑量的MeJA后才能產(chǎn)生最強(qiáng)的信號(hào)應(yīng)答，低劑量下或劑量過(guò)高，煙草產(chǎn)生的局部或系統(tǒng)性應(yīng)答強(qiáng)度都會(huì)減弱。Carolyn等也曾報(bào)道長(zhǎng)春花（Catharanthusroseus）細(xì)胞培養(yǎng)株分別用 10，50，100，500 μmol/L MeJA處理后，阿嗎堿（ajmalicine）在100 μmol/L處理中積累最多[19]，這可能與植物抗性的JA和SA路徑的應(yīng)答有關(guān)[20]，當(dāng)MeJA用量較低時(shí)，內(nèi)源JA的增加及相應(yīng)的抗性應(yīng)答隨著MeJA劑量增加而上升;然而，植物的這種應(yīng)答是有一定限度的，當(dāng)MeJA用量超過(guò)植物的應(yīng)答限度，多余的MeJA反倒會(huì)誘導(dǎo)SA信號(hào)路徑的功能性成份（如MeSA）增加，從而抑制JA信號(hào)路徑的應(yīng)答[21]。MeJA誘抗的這種劑量效應(yīng)特征提醒我們，在田間利用MeJA作誘抗處理時(shí)，一定要選擇合適的劑量才能取得最佳的誘抗效果。

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