甘草總黃酮物質(zhì)組分提取純化工藝研究

姜紅紅，孟憲生，康廷國，包永睿

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600）

在我國甘草藥用歷史悠久，得到廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其有益氣補中、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效，有“十方九草”之說。據(jù)《中國藥典》2010年版一部記載其原植物有3種，即烏拉爾甘草G.uralensis Fisch.、脹果甘草G.inflate Bat.和光果甘草G.glabra L.[1]。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黃酮、生物堿和氨基酸等化學(xué)成分，具有廣泛的生理活性[2]。甘草酸目前研究較深入，由于近年來人們發(fā)現(xiàn)其中黃酮類成分有較強的生物活性，已成為新的研究熱點。本實驗著眼于此，將對甘草總黃酮進(jìn)行提取純化工藝研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外可見光分光光度計（unico公司），安捷倫高效液相（Agilent 1100）（美國安捷倫公司），電子天平（ALC.1C.4）（Salto rius Group）。

1.2 試藥

聚酰胺、NKA-9、AB-8、D101、HPD-600、HPD-400、HPD-300大孔吸附樹脂（滄州寶恩有限公司），乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、冰醋酸（天津科密歐有限公司，分析純），乙腈（色譜純，Mtedia公司），甘草苷對照品（中國生物制品鑒定所，批號：111610-200604），甘草酸單銨鹽對照（中國生物制品鑒定所，批號：731-9403），甘草（經(jīng)本院翟延君教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.）。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草中總黃酮提取工藝的確定

2.1.1 方法

采用均勻設(shè)計[3]的方法確定考察因素為乙醇濃度、乙醇量、提取時間、提取次數(shù)、浸漬時間，并設(shè)定10個水平（表1）。將甘草生品粉碎（過60目篩），用天平精確量取分成若干袋，每袋凈含量15 g。取甘草15 g置于圓底燒瓶中，按照均勻設(shè)計表回流提取，合并提取液，提取液于100℃水浴中濃縮揮散溶劑，加水定容至100 ml，備用。

表1 黃酮類提取優(yōu)化均勻試驗Tab.1 Flavonoid optimized uniform design programming

2.1.2 結(jié)果

2.1.2.1 UV 測定 取蘆丁對照品溶液 1、2、4、6、8、10 ml于 25 ml量瓶中，分別加入0.5 ml、10%硝酸鋁溶液，再用70%乙醇定容，UV檢測；樣品制備：取1 ml樣品溶液，同上法，進(jìn)行UV檢測。檢測波長：420 nm。結(jié)果見表2。

表2 紫外法對甘草物質(zhì)組中總黃酮含量測定結(jié)果Tab.2 UV method determination results of total Flavonoids in Licorice material group

2.1.2.2 HPLC測定 樣品制備同“2.1.2.1”。取甘草苷對照品溶液（0.1 mg/ml）2、4、6、8、10 μl，進(jìn)樣，進(jìn)行 HPLC 檢測；色譜柱：Phenomenex-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流速：1 ml/min；柱溫：25℃；流動相：A-B（0.5%磷酸水溶液∶乙腈）梯度洗脫：0～10 min時 B 為 15%～25%；10～20 min時 B為 25%～32%；20～25min時B為32%～40%；25～40 min時 B為40%～55%。檢測波長：210、254、276、360 nm。 HPLC 測定結(jié)果見表 3。

表3 HPLC法對甘草物質(zhì)組中甘草苷含量測定結(jié)果Tab.3 HPLC method determination results of liquiritin in Licorice material group

2.1.2.3 提取結(jié)果 提取方程為：Y=108.4481-2.2939X5+0.0024X12-1.2721X32+0.0140X52-0.0073X62+0.6708X1X2-0.0131X1X5-2.7631X2X3+0.0611X2X5+0.0102X5X6，Q=0.0013，S=0.0364，R=1，F(xiàn)10，1=14067.3121＞F10，10.05=242。 最佳提取工藝：乙醇濃度為90%，12倍乙醇量，提取1次，提取時間1 h，提取前浸漬時間為5 h。

2.2 甘草總黃酮純化工藝的確定

2.2.1 有機溶劑萃取總黃酮

取提取液 50 ml（0.15 g/ml），共 5份，分別加入石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮各50 ml，振蕩10 min，靜置30 min。分別取有機層，揮散溶劑，加入70%乙醇定容至50 ml，分別精密取2 ml，分別加入0.5 ml 10%硝酸鋁溶液，再用70%乙醇定容，UV檢測。結(jié)果見表4。

表4 不同提取溶媒提取總黃酮含量測定結(jié)果Tab.4 Contents of total Flavonoids with different extraction solvent

由表4可知，乙酸乙酯萃取液的總黃酮量最大而石油醚萃取液的總黃酮量最小，幾乎沒有，則選用石油醚萃取除去小極性物質(zhì)，水層再用乙酸乙酯萃取得總黃酮物質(zhì)組。以蘆丁為對照品經(jīng)UV測定計算純度為67.24%，所以考慮用樹脂[4]繼續(xù)純化。

2.2.2 樹脂靜態(tài)吸附與洗脫

靜態(tài)吸附：選取不同極性的樹脂NKA-9、HPD-600、聚酰胺、HPD-400、D-101、AB-8、HPD-300，各量取 10 ml與錐形瓶中，精密吸取樣品100 ml（相當(dāng)于原藥材30 g）放入錐形瓶中靜置24 h，過濾，濾液定容與100 ml量瓶中，備用。按“2.1.2”項下HPLC含量測定方法進(jìn)行測定，計算吸附率，結(jié)果聚酰胺樹脂吸附率最大為87%。

靜態(tài)洗脫：過濾后的殘渣各放入200 ml 95%乙醇靜置24 h，過濾，濾液濃縮定容與100 ml量瓶中，備用。按“2.1.2”項下HPLC含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果聚酰胺樹脂解析率最大為47%，最終篩選出吸附率與解析率均最大的聚酰胺樹脂作為純化樹脂。

2.2.3 動態(tài)吸附與解吸

2.2.3.1 泄露曲線 取聚酰胺樹脂20 ml上樹脂柱，上樣量為100 ml（0.15 g/ml），做泄露曲線，經(jīng)泄露曲線得最大上樣量為90 ml（0.15 g/ml）。

2.2.3.2 動態(tài)吸附與解析 通過正交設(shè)計，選取因素為上樣濃度、流速、徑高比、上樣液 pH值，并設(shè)定3個水平，做 L9（34）正交試驗，以HPLC測定結(jié)果為指標(biāo)確定最佳純化工藝。得上樣液pH值項有顯著性差異，得最佳樹脂純化工藝為上樣液PH值為5，流速為1 ml/min，徑高比為1/10，上樣濃度為0.15 g/ml。再對解析液進(jìn)行考察：選擇90%、80%、70%、60%、50%乙醇分別進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮定容備用，按“2.1.2”項下UV含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果確定70%乙醇洗脫為最佳洗脫液；再對解析液用量進(jìn)行考察：選擇3BV、4BV、5BV、6BV、7BV 70%乙醇洗脫液濃縮，定容，備用，按“2.1.2”項下UV含量測定方法進(jìn)行測定，以蘆丁為對照品測定計算6BV 70%乙醇洗脫液純度為81.74%，為最高純度，所以確定洗脫液為6 BV 70%乙醇。由于純度不理想，所以選用乙酸乙酯又進(jìn)行萃取純化結(jié)果純度為87.41%，純度沒有達(dá)到90.00%，則選用同樣條件再過一次聚酰胺樹脂，以蘆丁為對照品經(jīng)UV測定計算出純度為90.12%。

3 討論

通過均勻試驗結(jié)合回流的提取方法，全面地考察了總黃酮提取所涉及的因素與水平，因為均勻設(shè)計考察的水平數(shù)量較均勻設(shè)計多，使結(jié)果更加合理。

通過UV檢測總黃酮并輔以HPLC測定甘草苷含量，結(jié)果均顯示總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度為90%，12倍乙醇量，提取1次，提取時間1 h，提取前浸漬時間為5 h。增加浸漬時間，減少加熱回流提取時間和提取次數(shù)，節(jié)省了能源。

通過樹脂動靜態(tài)考察最終確定過2遍聚酰胺樹脂且聚酰胺的粒度為200～300目。通過石油醚萃取除去大部分小極性物質(zhì)使純度達(dá)到67.00%；通過有機萃取結(jié)合樹脂工藝有效地純化甘草總黃酮，使其純度達(dá)到90.12%。

通過有機溶劑萃取時，把極性相似的三萜類同時提取出來了，導(dǎo)致純度一直上不去太高，所以通過樹脂柱來進(jìn)行進(jìn)一步純化；選擇了不同極性又是常用與黃酮醇化的樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附與解析，選擇出最佳吸附率尤其最佳解析率的聚酰胺樹脂進(jìn)行純化實驗[4-8]；首先對聚酰胺樹脂的最大上樣量進(jìn)行動態(tài)考察，通過以甘草苷為指標(biāo)的HPLC含量測定繪制出泄露曲線并確定最大上樣量為90 ml（0.15 g/ml）；確定最大上樣量之后，又對動態(tài)樹脂吸附條件通過L9（34）正交試驗進(jìn)行了考察，得到最佳樹脂動態(tài)吸附條件；對樹脂動態(tài)解析條件進(jìn)行摸索，通過UV測得含量最終確定最佳解析條件為6 BV入70%乙醇洗脫；由于純度仍不理想嘗試用有機溶劑在萃取純度仍上不去，且考慮到毒性，所以又一次選擇聚酰胺樹脂用相同靜動態(tài)條件進(jìn)行純化經(jīng)UV含量測定純度為90.12%。

通過均勻試驗確定了甘草黃酮類的最佳提取工藝為乙醇濃度為90%，12倍乙醇量，提取1次，提取時間1 h，提取前浸漬時間為5 h。通過有機萃取試劑篩選實驗確定選用石油醚萃取的方法除去小極性物質(zhì)，水層再用乙酸乙酯萃取得總黃酮物質(zhì)組，純度可達(dá)67%；通過樹脂動靜態(tài)的考察結(jié)合正交試驗確定甘草總黃酮物質(zhì)組最佳工藝參數(shù)即選用聚酰胺樹脂；上樣液pH值為5，流速為1 ml/min，徑高比為1/10，上樣濃度為0.15 g/ml；洗脫液為6 BV 70%乙醇；且以相同條件過2遍聚酰胺樹脂，純度最終達(dá)到90%。通過UV、HPLC儀器的檢測建立了測定甘草黃酮類含量的分析方法，為甘草的質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。通過一系列的提取與純化實驗，最終確定了甘草總黃酮的提取純化工藝參數(shù)，為基礎(chǔ)實驗研究及有效物質(zhì)組的機制研究提供科學(xué)可信合理有效物質(zhì)基礎(chǔ)。

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