人牙齦成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定

崔 娟 ，孫克勤 ，李 霞 ，張華屏

（1.山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030001）

人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblasts，HGFs）是牙齦結(jié)締組織中的主體細(xì)胞，在牙周組織的保護(hù)和修復(fù)中起重要作用[1]。許多學(xué)者利用牙齦成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，在牙周組織發(fā)病機(jī)制及治療方面進(jìn)行了有益的探索[2]。原代培養(yǎng)是獲取牙齦成纖維細(xì)胞的主要手段，目前有酶消化法和組織塊培養(yǎng)法[3]。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞，為進(jìn)一步研究細(xì)胞因子對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)液（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清（四季青，杭州）；胰蛋白酶（Sigma，美國(guó)）；抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（中杉金橋，北京）；25 ml塑料培養(yǎng)瓶、六孔板（Orange scientific，比利時(shí)）；RCO3000-7 CO2培養(yǎng)箱（REVCO，美國(guó)）；GB-Ⅱ超凈工作臺(tái)（北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織來(lái)源

牙齦組織取材于山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口外科門(mén)診因正畸需拔牙或者因手術(shù)需切除牙齦且牙齦無(wú)炎癥的患者，征得其同意后切取牙齦組織，患者年齡12～26歲。

1.2.2 組織塊法培養(yǎng)及傳代

新鮮切取的牙齦組織立即投入預(yù)冷含雙抗的DMEM培養(yǎng)液中（含青霉素 100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml），在超凈工作臺(tái)中用5倍抗生素溶液浸泡消毒，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中用眼科剪將牙齦組織剪成1 mm3大?。羟袝r(shí)在組織塊上滴加DMEM培養(yǎng)液，且盡量去除上皮組織），用牙科探針將組織塊以均勻間距分散接種于25 ml培養(yǎng)瓶壁上，倒置培養(yǎng)瓶在CO2培養(yǎng)箱中（5%CO2，95%空氣，100%濕度，37℃恒溫）孵育 4 h 后翻瓶，加入DMEM培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化，以 1∶2 或 1∶3傳代。

1.2.3 細(xì)胞的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞由組織塊邊緣游出的情況，觀察細(xì)胞形態(tài)及傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.3.2 免疫學(xué)鑒定 細(xì)胞傳至4代，制成1×105/cm2的細(xì)胞懸液，制備細(xì)胞爬片，按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)及DAB顯色步驟，分別進(jìn)行抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體染色，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替抗體作為陰性對(duì)照組，光鏡下觀察染色結(jié)果。

1.2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

取4代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的牙齦成纖維細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，加入DMEM培養(yǎng)液離心，將細(xì)胞稀釋為1×104～2×104/cm2，接種于 96 孔板中，200 μl/孔，每 24 小時(shí)測(cè)定一板，每孔加入 20 μl MTT 培養(yǎng) 4 h。吸出上清加入150 μl/孔 DMSO，室溫下振蕩10 min；490 nm處測(cè)定吸光度，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)成功率

本實(shí)驗(yàn)共接種10例牙齦組織，其中8例組織塊周?chē)屑?xì)胞游出，游出時(shí)間為10～15 d，接種的10例組織無(wú)一例污染，6例在細(xì)胞游出30 d左右長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底并傳代成功，其他2例未在30 d內(nèi)長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底且細(xì)胞有老化趨勢(shì)，被淘汰，細(xì)胞培養(yǎng)成功率為60%。

2.2 細(xì)胞傳代

細(xì)胞單層長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底80%可進(jìn)行傳代，用0.25%胰蛋白酶消化，不同形態(tài)的細(xì)胞對(duì)胰酶敏感性不同，成纖維樣細(xì)胞幾分鐘內(nèi)即被胰酶從瓶壁上消化下來(lái)，以此可分離成纖維細(xì)胞和上皮源性細(xì)胞，傳代后貼壁良好，形態(tài)不發(fā)生改變，生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，呈漩渦狀、柵欄狀、放射狀排列。

2.3 細(xì)胞鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

倒置顯微鏡下，原代及傳代生長(zhǎng)的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或星形，核呈圓形或橢圓形，有數(shù)目不等、長(zhǎng)短不同的胞質(zhì)突，核仁清晰可見(jiàn)，呈典型的成纖維樣細(xì)胞形態(tài)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀生長(zhǎng)，傳代后的細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀走行，排列緊密，有極性。

2.3.2 免疫學(xué)鑒定

光鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色觀察，顯示細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性，胞質(zhì)內(nèi)陽(yáng)性顆粒均勻分布，胞核清晰、無(wú)染色；抗角蛋白染色陰性，證明細(xì)胞為中胚層來(lái)源，且無(wú)上皮源性細(xì)胞混雜。陰性對(duì)照組均未見(jiàn)陽(yáng)性染色結(jié)果。

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 見(jiàn)圖1。

圖1 HGFs的生長(zhǎng)曲線

3 討論

牙周病是發(fā)生在牙齒支持組織（包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)）的慢性非特異性感染性疾病，是導(dǎo)致成年人失牙的主要原因[4]。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，牙周病尤其牙周炎更將成為突出的保健問(wèn)題，是學(xué)者研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。廣義上牙周病包括牙齦炎和牙周炎。牙齦炎是牙周炎的前驅(qū)和首要癥狀，防治牙齦炎可有效防止牙周炎的發(fā)生及發(fā)展。牙齦成纖維細(xì)胞是牙齦結(jié)締組織中的主體細(xì)胞，不僅具有活躍的自身更新能力，而且可合成膠原纖維、彈性纖維及基質(zhì)[5]。已有報(bào)道牙齦成纖維細(xì)胞具有一定的潛在成骨能力，使牙齦成纖維細(xì)胞有望成為牙周組織工程的種子細(xì)胞[6-7]。此外，牙齦成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)成活率高于牙周膜成纖維細(xì)胞，取材方便，創(chuàng)傷較小。因此，體外建立牙齦成纖維細(xì)胞模型有利于今后對(duì)牙周組織炎癥機(jī)制和防治措施的進(jìn)一步研究。

細(xì)胞原代培養(yǎng)目前有酶消化法和組織塊培養(yǎng)法，本實(shí)驗(yàn)利用組織塊法，操作簡(jiǎn)便，污染率低，創(chuàng)傷小，成活率較高，進(jìn)一步證實(shí)組織塊法是培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞的經(jīng)典方法。通過(guò)形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)鑒定，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或星形，抗波形絲蛋白抗體陽(yáng)性，抗角蛋白抗體陰性，證明是中胚層非上皮來(lái)源細(xì)胞，結(jié)合組織取材部位，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的是人牙齦成纖維細(xì)胞。在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，由于操作和條件的限制，有時(shí)不能完全去除上皮組織而混有上皮源性細(xì)胞，但兩種細(xì)胞對(duì)胰酶的敏感性不同，消化時(shí)間長(zhǎng)短不同，因此可通過(guò)傳代純化成纖維細(xì)胞[3]。

細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，組織中分離的原代細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞性狀相似，較好地保存了細(xì)胞的遺傳特征和生物學(xué)特性[8]，又避免了體內(nèi)研究所受的多因素干擾，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。但是體外培養(yǎng)的細(xì)胞反復(fù)傳代性狀有可能發(fā)生改變。因此，體外培養(yǎng)的細(xì)胞要在穩(wěn)定的狀態(tài)下方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及對(duì)繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)行分析顯示，3～6代牙齦成纖維細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，適于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；8代以后細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)改變，有融合老化趨勢(shì)，不再適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

細(xì)胞培養(yǎng)的成功與否受到很多因素的影響，①新鮮組織的消毒：盡量避免組織過(guò)多在外暴露及與其他有菌物品接觸，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用一定濃度的抗生素既防止污染又不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)；②減少影響接種時(shí)細(xì)胞貼壁的不利因素：接種4 h內(nèi)應(yīng)盡量不移動(dòng)培養(yǎng)瓶，而且接種時(shí)組織塊的濕潤(rùn)程度要適中；③培養(yǎng)液胎牛血清的濃度：細(xì)胞從組織塊游出過(guò)程中，培養(yǎng)液中胎牛血清的濃度高，更利于細(xì)胞生長(zhǎng)；④無(wú)菌觀念：操作的全部過(guò)程都要謹(jǐn)慎保持無(wú)菌觀念，使細(xì)胞生長(zhǎng)良好。

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