同型半胱氨酸血癥對大鼠骨折愈合的影響

秦晉峰，李金庫

（1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，山西太原 048205；2.山西省晉煤集團(tuán)總醫(yī)院寺河分院，山西晉城 048006）

高同型半胱氨酸血癥（HHCY）是一個(gè)廣泛的代謝問題，被認(rèn)為是心血管疾病與骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素[1-2]。老年人患有高同型半胱氨酸血癥主要與缺陷的維生素B6、維生素B12、葉酸以及腎功能不全有關(guān)[2-5]。

近年研究表明，患有同型半胱氨酸血癥的患者骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率較高[6-7]。體外研究表明，同型半胱氨酸（HCY）能夠刺激破骨細(xì)胞的擴(kuò)散和成骨細(xì)胞的凋亡[8-12]。這可能對其他組織向骨組織的轉(zhuǎn)化有不利影響，正如臨床實(shí)驗(yàn)中對骨代謝的血清學(xué)標(biāo)志物分析結(jié)果所示。

雖然已經(jīng)證實(shí)同型半胱氨酸血癥是骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松性骨折的一個(gè)新的危險(xiǎn)因素，但并不能說明這些代謝改變也影響骨折愈合。在高同型半胱氨酸的血藥濃度下，破骨細(xì)胞的非生理增殖可能影響骨折愈合過程。因此，本實(shí)驗(yàn)假設(shè)同型半胱氨酸飲食所致的高同型半胱氨酸血癥與骨折修復(fù)受損有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)組 SD大鼠（體重 300～400 g，12只），分別喂同型半胱氨酸，并補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)飲食。基于先前的一項(xiàng)大鼠數(shù)據(jù)研究[10]，大鼠喂養(yǎng)同型半胱氨酸，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食3周之后制作股骨骨折模型。對照組以標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)，3周后制作股骨骨折模型。根據(jù)對大鼠骨折愈合的研究，造模4周后處死動物，制作骨折標(biāo)本并進(jìn)行放射性學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)分析。此外，采集血液樣品，評價(jià)兩組大鼠同型半胱氨酸的血藥濃度。

1.2 造模

大鼠腹腔注射二甲苯胺噻嗪（25 mg/kg）及氯胺酮（75 mg/kg）進(jìn)行麻醉。每只大鼠用三點(diǎn)壓力裝置造成右股骨骨折模型并用髓內(nèi)釘固定，通過骨折碎片之間的壓力在軸向與抗旋上保持骨折在術(shù)后的穩(wěn)定性。根據(jù)AO原則，骨折類型為股骨干骨折A2～A3型。

1.3 血清同型半胱氨酸濃度分析

處死前，行下腔筋脈穿刺獲取血液樣品，放置30 min后用離心機(jī)離心分離出血清。血清標(biāo)本于-80℃存放等待分析。使用氣相色譜質(zhì)譜法測定同型半胱氨酸的血藥濃度。區(qū)域內(nèi)和區(qū)間變異系數(shù)分別為3.2%和6.7%。

1.4 生物力學(xué)測試

取出髓內(nèi)釘后，大鼠股骨固定于三點(diǎn)彎曲裝置。三點(diǎn)彎曲裝置以恒速為1 mm/min、最大10 N的背轉(zhuǎn)力作用于鼠股骨中心（骨折水平處）。連續(xù)監(jiān)測負(fù)載和股骨形變，并繪制出負(fù)載-形變曲線。

1.5 組織形態(tài)學(xué)觀察

在組織形態(tài)測試中，未脫鈣股骨固定于4%中性甲醛溶液中，并用乙醇脫水，最后用聚甲基丙烯酸甲酯包埋。然后沿矢狀平面做薄切片（7 μm），并用甲苯胺藍(lán)-亞甲藍(lán)染色。組織切片在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察。股骨中部與邊緣為被觀測區(qū)域，觀測目標(biāo)包括骨、軟骨、結(jié)締組織和骨髓。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 X線分析

X線顯示，4周內(nèi)實(shí)驗(yàn)組大鼠與對照組大鼠內(nèi)置物與骨折端無明顯移位，并且骨折縫隙減少，兩組大鼠骨折處均有骨痂形成。

2.2 血清同型半胱氨酸濃度分析結(jié)果

喂食同型半胱氨酸補(bǔ)充飲食的實(shí)驗(yàn)組大鼠同型半胱氨酸血藥濃度為（102.2±64.5）μmol/L，與標(biāo)準(zhǔn)飲食的對照組的（2.8±1.5） μmol/L 比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。兩組大鼠活躍度與體征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），組間個(gè)體體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后3 d所有個(gè)體均活動自如，行動不受限。

2.3 生物力學(xué)分析結(jié)果

骨折后4周，實(shí)驗(yàn)組大鼠愈傷組織的抗彎剛度為（45.5±18.2） N/mm，與對照組的（64.6±15.8） N/mm 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果

在骨折愈合的4周內(nèi)所有樣本顯示出典型的骨折愈合模式。增生組織以編織成骨為主，并且喂食同型半胱氨酸補(bǔ)充飲食的實(shí)驗(yàn)組大鼠骨痂生成的直徑小于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。對照組大鼠中沒有發(fā)現(xiàn)纖維軟骨，但在實(shí)驗(yàn)組中有2只出現(xiàn)纖維軟骨(表1)，表明在骨愈合和改建過程中這2只大鼠要慢于沒有表達(dá)纖維軟骨的大鼠。

表1 組織形態(tài)學(xué)分析（）

表1 組織形態(tài)學(xué)分析（）

指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)組 對照組愈傷組織直徑（mm）2.0±0.32.3±0.5愈傷組織面積（mm2）2.1±0.91.8±0.8組織構(gòu)成骨組織（%）41.9±11.544.1±19.3軟骨組織（%）0.9±1.60.0±0.0纖維組織（%）56.8±10.956.1±19.5

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了本研究的假說，即同型半胱氨酸飲食與骨折愈合之間存在關(guān)聯(lián)。血清分析結(jié)果證明同型半胱氨酸飲食可導(dǎo)致高半胱氨酸血癥。大鼠喂食同型半胱氨酸引起嚴(yán)重的高半胱氨酸血癥[5]，實(shí)驗(yàn)組同型半胱氨酸血清濃度為（102.2±64.5）μmol/L，約為對照組[(2.8±1.5)μmol/L]的 40倍。 迄今為止，只有少數(shù)研究使用動物模型分析同型半胱氨酸血癥對骨代謝的影響。通過給大鼠喂食甲硫氨酸等[8]使其同型半胱氨酸血清濃度上升到16 μmol/L，形成溫和的同型半胱氨酸血癥[5]。Herrmann等[9]通過給大鼠喂食甲硫氨酸與標(biāo)準(zhǔn)飲食，可使大鼠同型半胱氨酸血清濃度達(dá)到（27.0±8.8）μmol/L，從而也形成溫和的同型半胱氨酸血癥。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同型半胱氨酸血癥組骨折愈合組織的面積和股骨的力學(xué)強(qiáng)度比對照組大鼠都有不同程度的降低；也說明大鼠骨折愈合與血清高濃度同型半胱氨酸的相關(guān)性。另一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)表明，在高同型半胱氨酸血癥大鼠的骨組織中有同型半胱氨酸累積，并且其骨密度降低[10]。

最近在體外和體內(nèi)的研究都表明，在骨吸收過程中同型半胱氨酸濃度升高[8-12]。此外，幾個(gè)橫斷面研究已經(jīng)顯示出同型半胱氨酸濃度的升高和骨吸收的增加之間有明顯的聯(lián)系。體外研究證實(shí)在破骨細(xì)胞的活動中同型半胱氨酸含量增加[11]。另一方面，同型半胱氨酸血癥影響骨代謝仍然是一個(gè)有爭議的話題，因?yàn)槠渌芯糠裾J(rèn)同型半胱氨酸的血清濃度升高和增加骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

同型半胱氨酸血癥影響骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞的活動，兩者是骨折愈合過程中的關(guān)鍵細(xì)胞[1,12]。但是，關(guān)于這個(gè)問題的數(shù)據(jù)也是矛盾的。體外研究表明，低濃度的同型半胱氨酸可刺激成骨細(xì)胞，但據(jù)報(bào)道高濃度的同型半胱氨酸對成骨細(xì)胞有毒性作用[1]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)表明同型半胱氨酸飲食可導(dǎo)致嚴(yán)重的同型半胱氨酸血癥，擾亂了大鼠的骨修復(fù)。改變破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和活性是否能導(dǎo)致這一結(jié)果，對伴有同型半胱氨酸血癥的骨折患者的治療非常重要。

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