早期應(yīng)用丹參川芎嗪注射液對(duì)局灶性腦缺血-再灌注損傷大鼠血-腦屏障通透性的影響

牛文華，牛小媛，劉鳳琴

（山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西太原 030001）

血-腦屏障（BBB）由三種結(jié)構(gòu)組成：毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接、基底膜以及星形膠質(zhì)細(xì)胞。它可以阻止血液中的某些物質(zhì)向中樞轉(zhuǎn)運(yùn)，從而保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。腦缺血-再灌注損傷后，由于BBB開放，通透性改變，血液中的某些有害物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入腦內(nèi)，從而加重腦的損傷，因此對(duì)干預(yù)BBB的通透性的治療具有重要的臨床意義。丹參川芎嗪注射液已被廣泛地用于心、腦、腎各個(gè)器官的保護(hù)性治療[1-3]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察丹參川芎嗪注射液對(duì)腦缺血-再灌注后BBB通透性的影響，探討其對(duì)腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用，對(duì)臨床應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠，體重250～300 g。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組及缺血-再灌注組，然后將缺血-再灌注組按照再灌注時(shí)間分為再灌注 3、12、24、48、72 h 組，每組 6 只。 在 EB 含量漏出最多的時(shí)間點(diǎn)，設(shè)鹽水組和SLI組。

1.2 動(dòng)物模型制備及神經(jīng)病學(xué)評(píng)分

1.2.1 造模 造模前大鼠禁食24h，用10%水合氯醛（350mg/100 g）腹腔注射，頸部正中切開皮膚，分別分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）及頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），在ECA上剪一小口，將線栓子插入大腦中動(dòng)脈（MCA）的開口處，魚線插入深度平均為（18.5±0.5）mm。缺血后2 h實(shí)施再灌注，然后緩慢回抽魚線，使其頭端回撤至CCA內(nèi)。假手術(shù)組不插入線栓，其他步驟同上。1.2.2神經(jīng)功能評(píng)分 參照Zea Longa 5分制神經(jīng)功能評(píng)分，0分：肢體活動(dòng)正常；1分：左側(cè)前肢不能完全伸展；2分：行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。0分和4分者均被剔除。

1.3 BBB通透性評(píng)價(jià)

按照Uyama等[4]的方法，在再灌注后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)前1 h用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)股靜脈注入2%EB生理鹽水溶液（4 ml/kg）1 h后，左心室灌注生理鹽水，斷頭取腦，取右側(cè)背外側(cè)新皮層，將其稱重后勻漿，而后離心，提取上清液。上清液用無水乙醇按1∶3稀釋，由熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出EB含量（μg/ml），然后與組織的質(zhì)量相比，得到每克腦組織的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，多組定量資料間比較用方差分析，兩組資料間比較采用t檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血-再灌注不同時(shí)間點(diǎn)BBB通透性的變化

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血-再灌注后3 h腦組織EB含量較正常組增多，再灌注24 h達(dá)高峰，再灌注48 h、72 h EB含量較再灌注24 h時(shí)下降，但仍高于對(duì)照組。12 h組和48 h組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮層EB含量比較（）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮層EB含量比較（）

組別 只數(shù) EB含量（μg/g） F值 P值對(duì)照組60.582±0.121再灌注3 h組60.977±0.128再灌注12 h組64.240±0.397266.802 <0.001再灌注24 h組65.543±0.396再灌注48 h組64.225±0.360再灌注72 h組62.615±0.231

2.2 丹參川芎嗪注射液對(duì)腦缺血-再灌注后BBB通透性的影響

在缺血2 h再灌注24 h設(shè)SLI組和鹽水組，結(jié)果顯示，SLI組腦組織EB含量明顯低于鹽水組。

表2 兩組干預(yù)后腦組織EB含量比較（）

表2 兩組干預(yù)后腦組織EB含量比較（）

分組 只數(shù) EB含量（μg/g） t值 P值鹽水組65.540±0.3854.853 <0.05 SLI組64.405±0.423

3 討論

丹參、川芎為傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，丹參可改善微循環(huán)、抗氧化、抗感染、下調(diào)ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)[5-7]。川芎嗪可擴(kuò)張血管、減少腦缺血時(shí)氧自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗感染等作用[8-9]。SLI是在丹參注射液與鹽酸川芎嗪注射液的基礎(chǔ)上研制出的中西藥復(fù)方制劑，已被用于臨床研究，集中體現(xiàn)了丹參注射液及鹽酸川芎嗪注射液的功效。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)大鼠損傷側(cè)腦組織內(nèi)EB含量顯示，在腦缺血-再灌注3 h時(shí)，EB含量開始增加，即BBB的通透性開始上升，再灌注24 h達(dá)高峰。取BBB通透性最大的缺血-再灌注時(shí)間點(diǎn)，給予丹參川芎嗪注射液干預(yù)，結(jié)果顯示，丹參川芎嗪注射液能降低腦組織中的EB含量，即表示它能夠降低BBB通透性的升高程度。已有研究表明，BBB通透性升高與腦組織缺血-再灌注損傷過程中過多生成的OFR與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)生成過氧化脂質(zhì)及損害血管內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[10]。丹參川芎嗪注射液中的丹參素和川芎嗪分子量小，可以直接透過BBB，從而能直接滅活黃嘌呤氧化酶，提高SOD活性[11]，對(duì)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)起到抑制作用，這可能是丹參川芎嗪注射液能夠降低腦缺血-再灌注損傷大鼠BBB通透升高程度的原因。雖然本研究結(jié)果顯示丹參川芎嗪注射液可減輕BBB通透性的升高程度，但是在此過程中丹參川芎嗪注射液的具體作用機(jī)制尚不明確，還需要做更進(jìn)一步的后續(xù)研究。

[1]黃志清,路杰,麥偉民.參芎葡萄糖注射液治療腎病綜合征療效觀察及對(duì)血液流變學(xué)的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):中醫(yī)臨床版,2008,15(4):10-11.

[2]陳孝東,曹勇軍,王引明,等.參芎注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].國際腦血管病雜志,2006,14(4):270-274.

[3]田樺,邵艷艷,卓越.丹參川芎嗪對(duì)胰腺炎患者血清IL-1β和TNF-α含量的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2008,31(4):28-29.

[4]Uyama O,Okamura N,Yanse M,et al.Quantitative evaluation of vascular permeability in the gerbil brain after transient ischemia using Evans blue fluorescence[J].J Cereb Blood Flow Metab,1988,8(2):282-284.

[5]沈霞,崔桂云,劉永海.丹參對(duì)大鼠全腦缺血-再灌注后海馬CA-1區(qū)AP-1 DNA結(jié)合活性的影響[J].中華神經(jīng)科雜志,2004,37(2):174-177.

[6]Kim SY,Moon TC,Chang HW,et al.Effects of Tanshinone I isolated from Salviamiltiorrhiza Bunge on arachidonic acid metabolism and in vivo inflamematory responses[J].Phytother Res,2002,16(7):616-620.

[7]Ding M,Zhao GR,Yuan YJ,et al.Aqueous extract of salvia miltiorrhoza regulates adhesion molecule expression of tumor necrosis factor[alpha]-induced endothelial cells by blocking activation of nuclear factor[kappa]B[J].J Cardiovascular Pharmacology,2005,45(6):516-524.

[8]Zhang Z.Tetrame thylpyrazine decreases nitric oxide in human polymerph on uclear leukocytes[J].Life Sci,2003,72(22):2465-2472.

[9]Zhao H,Dong X,Wang X,et al.Studies on single-cell adhesion probability between lymphocytes and endothelial cells with micropipelle technique[J].Microvasc Res,2003,63(2):216-218.

[10]Kontos HA.Oxygen radicals in cerebral ischemia:the 2001 Willis lecture[J].Stroke,2001,32(11):2712-2716.

[11]蔡威黔,繆建春,駱佑娣.丹參、川芎嗪復(fù)方制劑對(duì)老年性癡呆模型大鼠紅細(xì)胞及腦組織SOD、MDA的影響研究[J].中國藥房,2008,19(21):1608-1609.