單雙波長(zhǎng)在生物活性測(cè)定中的比較研究

趙 鴻

（北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，北京 100041）

生物制品活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)大多用MTT法，使用酶標(biāo)儀掃描比色，通過(guò)數(shù)據(jù)分析得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一般酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)兩種測(cè)定模式[1-2]，而且采用的都是垂直光路。選擇單波長(zhǎng)測(cè)定就是選擇測(cè)定波長(zhǎng)[3]，直接測(cè)定樣本的吸光度。而雙波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)采用不同的波長(zhǎng)，即測(cè)定波長(zhǎng)（主波長(zhǎng)）和參比波長(zhǎng)（次波長(zhǎng)）同時(shí)測(cè)定樣品的吸光度，以清除一些外在影響因素，提高測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。但鑒于日常工作關(guān)于單雙波長(zhǎng)對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度不是很了解，因此想通過(guò)此次比較實(shí)驗(yàn)了解單雙波長(zhǎng)對(duì)生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的大小以及單雙波長(zhǎng)哪個(gè)更適合于生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Emax酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀器公司）；單道移液器[1ml（Gilson）、200 μl（Gilson）、20 μl（Gilson）]；8 道移液器（Finnpipette）。

1.2 試藥

本公司生產(chǎn)的 IL-11 成品（批號(hào)：20080801，600 U IU/支）；IL-11 原液（批號(hào)：20080804，4.563 mg/ml）。

2 方法與結(jié)果

2.1 MTT比色法

B9-11細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/ml，每孔加入 50 μl細(xì)胞懸液，再加入 50 μl待測(cè)的樣品（空白對(duì)照孔加 50 μl培養(yǎng)基），在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 72 h后，每孔加入 5 mg/ml的 MTT溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后加入MDF裂解液100 μl，37℃孵育過(guò)夜，酶標(biāo)儀掃描570 nm或570 nm+630 nm測(cè)定OD值，使用軟件SOFTmaxPRO 3.1分析得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 單雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果比較

本公司生產(chǎn)的 IL-11成品（批號(hào)：20080801，600 U IU/支）和 IL-11 原液（批號(hào)：20080804，4.563 mg/ml）的單波長(zhǎng) 570 nm和雙波長(zhǎng)570 nm+630 nm測(cè)定結(jié)果的比較[1]，見(jiàn)表1、2。

由表1、2可知，成品和原液相應(yīng)的單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果相接近，單波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)方差和CV（%）明顯高于雙波長(zhǎng)。

表1 IL-11成品兩種測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Resluts of two detecting methods of finished product IL-11

表2 IL-11原液兩種測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果Tab.2 Resluts of two detecting methods of original liquid IL-11

2.3 IL-11成品單雙波長(zhǎng)各掃描兩次測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性比較[4] 見(jiàn)表3。

表3 IL-11成品單雙波長(zhǎng)兩次測(cè)定結(jié)果Tab.3 Resluts of Dual-wavelength method of finished product IL-11

由表3可知，單波長(zhǎng)兩次測(cè)定結(jié)果比雙波長(zhǎng)兩次測(cè)定結(jié)果差異大，雙波長(zhǎng)測(cè)定兩次的結(jié)果重復(fù)性好于單波長(zhǎng)。

2.4 IL-11成品單雙波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差的比較 見(jiàn)表4。

表4 IL-11成品兩種測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差Tab.4 RSD of two kinds of detecting methods of finished product IL-11

由表4可知，單波長(zhǎng)測(cè)定方法的相對(duì)偏差明顯高于雙波長(zhǎng)測(cè)定。

2.5 IL-11樣品生物活性測(cè)定細(xì)胞空白吸光度的比較 見(jiàn)表5。

表5 IL-11樣品生物活性測(cè)定細(xì)胞空白對(duì)照孔吸光度OD值Tab.5 Blank absorbance on bioactivity detection of sample IL-11

由表5可知，雙波長(zhǎng)可以排除一部分劃痕和洗滌劑對(duì)實(shí)驗(yàn)的可能干擾，其吸光度OD值明顯小于單波長(zhǎng)。

為了降低檢驗(yàn)成本，生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)所使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板均非一次性使用，不可避免的存在劃痕和洗滌劑等殘留物。

3 討論

單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)通過(guò)對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如570 nm進(jìn)行吸光度測(cè)定[1]，而雙波長(zhǎng)測(cè)定則是酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如570 nm和非敏感波長(zhǎng)630 nm下各測(cè)定1次，敏感波長(zhǎng)下的吸光度為特異性顯色的吸光度與板底被贓物（包括劃痕）污染后的吸光度之和，非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定的是改變波長(zhǎng)到一定值，使特異顯色的吸光值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為贓物的吸光度，最后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)吸光度值與非敏感波長(zhǎng)的吸光度值的差。

酶標(biāo)儀采用垂直光路，特點(diǎn)是樣品吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小，但受被測(cè)樣品液面是否水平、細(xì)胞板的透光性、孔底是否平整等因素的影響較大。 因此孔與孔之間存在一定的差異。

酶標(biāo)儀在用單波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，除受到測(cè)定的干擾和電路干擾等因素外，受液體表面張力的影響也很大。由于表面張力的作用，液體的表面不是一個(gè)平面，而是形成一個(gè)凹液面，光線(xiàn)通過(guò)液體時(shí)，除被液體吸收一部分，還有一部分被折射和反射，影響吸光度的檢測(cè)，且使用的洗滌劑均含有表面活性劑，這樣液面會(huì)更凹，對(duì)單波長(zhǎng)的影響更大。雙波長(zhǎng)的測(cè)定時(shí)采用兩個(gè)不同波長(zhǎng)（測(cè)定波長(zhǎng)和參比波長(zhǎng)）同時(shí)測(cè)定一個(gè)樣品的吸光度，它們的差值是樣品相對(duì)準(zhǔn)確的吸光度，這樣就會(huì)減少了測(cè)定干擾和電路干擾。

雙波長(zhǎng)差吸光度法具有可以克服一些外界環(huán)境的影響[5-6]，共存組分吸收譜疊加的干擾，以及減少比色的光學(xué)不均一性等特點(diǎn)，吸光度在一定的范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

因此，雙波長(zhǎng)測(cè)定明顯比單波長(zhǎng)更適合于生物活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，其可以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析的準(zhǔn)確度，減少實(shí)驗(yàn)誤差。

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[2]李正勇.酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)檢測(cè)技術(shù)分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2005,21(1):24.

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