黃連湯有效部位對鴨疫里氏桿菌的抑菌率

紀麗莎，殷紅福，汪麗芬，張先福

（浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術(shù)學院，浙江 臨安311300）

鴨疫里氏桿菌Riemerella anatipestifer病，也稱鴨傳染性漿膜炎，是鴨的一種細菌性傳染病，死亡率達30%～50%。該病以纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎、輸卵管炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等為主要病變特征［1－2］。鴨疫里氏桿菌具有21個血清型，各血清型相互之間沒有交叉免疫力，免疫預防效果不佳［3－5］；且鴨疫里氏桿菌對各類抗生素極易產(chǎn)生耐藥性［6－7］，在很多地區(qū)已經(jīng)難以找到對鴨疫里氏桿菌敏感的藥物。鑒于此，我們前期試驗篩選出對鴨疫里氏桿菌病具有顯著效果并由黃連Coptis chinensis，黃柏Phellodendrion amurense和甘草Glycyrrhiza uralensis 3味中藥組成的中藥復方黃連湯［8］。經(jīng)HPLC 測定，黃連湯有效成分分別為小檗堿 299.73 mg·kg－1，藥根堿 108.66 mg·kg－1，甘草酸 9.00 mg·kg－1，鹽酸小檗堿 5.7 g·kg－1，鹽酸巴馬汀 254.00 mg·kg－1（中草藥已錄用）。為了進一步研究黃連湯對鴨疫里氏桿菌中外膜蛋白的作用，本研究開展了黃連湯提取物對鴨疫里氏桿菌的抑菌率研究，為中藥抗菌機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材 黃連、黃柏和甘草均購自浙江省臨安市中醫(yī)院。

1.1.2 菌株及試劑 鴨疫里氏桿菌，由浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所提供，由筆者所在實驗室進行擴增培養(yǎng)。胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）［9］作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制固體培養(yǎng)基時，另按15 g·kg－1加瓊脂粉，制成胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 UV-2450型精密紫外分光光度計（島津國際貿(mào)易有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（杭州藍天化驗儀器廠），全自動高壓滅菌鍋（廣州東南科儀有限公司）

1.2 方法

1.2.1 中藥原料處理 采用水提醇沉法：取黃連2 g，黃柏2 g，甘草4 g放入燒杯中，加適量的水，浸泡，煮沸后用小火持續(xù)20～30 min（視藥物而定）；濾出煎液，濾渣加水，進行第2次煎煮（20～30 min）；濾出煎液，合并2次濾液，用紗布過濾，得濾液75.0 mL，加入體積分數(shù)為95%乙醇225 mL，4℃下靜置24 h，濾紙過濾除沉淀，在75℃下減壓回收乙醇，85℃下繼續(xù)濃縮得原藥34.8 mL，藥液含生藥229.9 g·L－1，微孔濾膜過濾除菌后，放置在－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鴨疫里氏桿菌的復蘇和菌懸液的制備［10］在TSB肉湯培養(yǎng)基中加入15 g·kg－1瓊脂，加熱溶解，121℃高壓滅菌20 min，傾倒在平板培養(yǎng)皿內(nèi)，以此用作凍干菌株的復蘇平板培養(yǎng)基。利用平板劃線法將凍干菌株接種至平板內(nèi)，37℃，培養(yǎng)24 h后，挑取單個生長的菌落，轉(zhuǎn)種至TSB肉湯培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)12 h。此為菌懸液。

1.2.3 擴增培養(yǎng) 取培養(yǎng)12 h的菌懸液100 μL，加至裝有TSB的肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱，分別培養(yǎng)0，2，4，6，8和10 h，對各個時間段的生長菌落進行計數(shù)，并測定吸光度值。

1.2.4 菌落計數(shù)和吸光度值的相關(guān)性分析 采用平板菌落計數(shù)法［11］。將定時培養(yǎng)的菌液進行10－1，10－2，10－3，…，10－7，10倍遞增稀釋，然后分別取不同稀釋度的菌液100 μL滴加于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板上，用無菌涂棒涂布均勻，每個稀釋度重復3塊平板，37℃溫箱中培養(yǎng)12 h。統(tǒng)計平板上生長的活菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以10，即為菌濃度（×1010個·L－1）。定時吸取適量菌液和參比液，將參比液調(diào)0后，測定菌懸液的吸光度DO600。該試驗設(shè)3次重復。

1.2.5 藥物稀釋與菌液接種 取無菌試管，將黃連湯原液與培養(yǎng)基按照1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7的體積比稀釋，藥物質(zhì)量濃度分別為115.0，77.0，57.0，46.0，38.0，33.0和29.0 g·L－1，分別放置到各個試管中。接種菌懸液20，50，120，190和250 μL到各組配制好的試管藥液中。置于37℃，180 r·min－1的恒溫搖床中培養(yǎng)12 h。該試驗設(shè)3次重復。另取1支含菌懸液的試管作對照，此為凈生長量。

1.2.6 抑制生長率的計算 將不同藥物的光密度值代入到鴨疫里氏桿菌生長曲線的線性關(guān)系方程式中，計算抑制生長率。抑制生長率=（細菌凈生長量－處理凈生長量）/細菌凈生長量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果用Excel處理，用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA分析和回歸分析［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨疫里氏桿菌濃度標準曲線

細菌在培養(yǎng)了0，2，4，6，8和10 h后，取3.0 mL細菌懸液與參比液，進行吸光度DO600測定，以吸光度為橫坐標，以菌濃度為縱坐標（ × 1010個·L－1），繪制標準曲線［13］（圖1）。

曲線方程為y=0.485 1e1.9068x，R2=0.981 1。將其化為線性模型后進行顯著性檢驗，得F=156.006＞F0.01（1，3） =34.1，說明在 0.01 水平上兩者相關(guān)性顯著，線性關(guān)系良好。

圖1 鴨疫里氏桿菌的吸光度和菌濃度的標準曲線Figure 1 Curve between OD values and the concentration of Riemerella anatipestifer

2.2 不同質(zhì)量濃度中藥浸提物對不同菌量的抑制效果

通過肉眼觀察，菌量為20 μL時藥物質(zhì)量濃度在33.0 g·L－1時液體出現(xiàn)混濁，38.0 g·L－1時有絮狀物；菌量在50和120 μL時，藥物質(zhì)量濃度大于38.0 g·L－1時液體較清澈，但46.0 g·L－1有絮狀物；菌量在190和250 μL時，藥物質(zhì)量濃度在38.0 g·L－1時，液體出現(xiàn)混濁，在57.0和46.0 g·L－1都有絮狀沉淀，但57.0 g·L－1透明度大于46.0 g·L－1。從結(jié)果可以看出，黃連湯有抑菌效果，但其抑制效果不能得出確切數(shù)值?，F(xiàn)通過定量的方法來測定抑制率。紫外分光光度計測定各菌量的吸光度值見表1。

表1 不同藥物質(zhì)量濃度下對應的吸光度Table 1 OD values of various drug concentrations corresponding

從表1中可以看出，除第7組外，隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，吸光度依次遞減，抑制率依次增大，但第7組的吸光度值小于第6組。將以上吸光度值數(shù)據(jù)代入到曲線方程中，得到各吸光度對應的菌濃度（表2）。

由表2說明，藥物質(zhì)量濃度在29.0 g·L－1時，95%的菌已經(jīng)被抑制。菌濃度小于0.7×1010個·L－1時，液體已經(jīng)處于澄清透明。橫向?qū)Ρ龋?組和第2組外，第3組到第7組隨著菌量的增加，菌濃度依次增大。將以上菌濃度通過抑菌生長率公式求得各質(zhì)量濃度對應的抑菌率（表3）。

通過上表可見，通過縱向?qū)Ρ?，菌量?0和50 μL時，藥物質(zhì)量濃度的顯著性差異出現(xiàn)在第3組，菌量在120，190和250 μL時，藥物質(zhì)量濃度的顯著性差異出現(xiàn)在第4組，與肉眼觀察不相吻合。各個菌量的抑菌率分別為99.99%，99.98%，99.99%，99.98%和99.98%，抑菌率都在99.98%以上。

表2 藥物質(zhì)量濃度作用下對應的菌濃度Table 2 Bacterial content of under the action of various drug concentrations

表3 黃連湯有效部位抑菌率Table 3 Antibacterial rate of ethanol extracts of Coptidis rhizoma Decoction against Riemerella anatipestifer

3 討論

從表1中可以看出，除第7組外，其余藥物質(zhì)量濃度組隨著藥物質(zhì)量濃度的增大，吸光度值依次遞減，抑制率依次增大，但第7組的吸光度值小于第6組。藥物質(zhì)量濃度在77.0 g·L－1時抑菌效果最佳。試驗說明，藥物質(zhì)量濃度越大抑制細菌的效率反而會減弱，可能因為中藥是由多種復雜成分構(gòu)成，不是所有成分都直接作用于致病菌達到抑制細菌的目的，有些成分會因為藥物質(zhì)量濃度的增高起到自身抑制的效果，故中藥的抑制率反而會減少，甚至有些中藥的抗菌有效成分在體外抑菌試驗中測不出或顯示不強，但在體內(nèi)卻有較好的抑菌效果（如魚腥草Houttuynia cordata）［14］。前期試驗已經(jīng)證明，鴨疫里氏桿菌對人工發(fā)病鴨具有顯著的治療效果。

通過肉眼觀察，菌量為20，50，120，190和250 μL時，對應的含有絮狀物的藥物質(zhì)量濃度分別為38.0，46.0，46.0，57.0和57.0 g·L－1。由表2的數(shù)值可以看出，絮狀物都出現(xiàn)在0.5×1010～0.6×1010個·L－1，是抑制與非抑制的臨界值，可能是細菌在生長時與藥物對抗直至被殺死后所產(chǎn)生細菌死亡之后的菌體變?yōu)樾鯛钗?，而大于臨界值的細菌未被抑制住，會使菌液混濁；小于臨界值的細菌被藥物抑制，使液體澄清透明。死亡之后的菌體給實驗人員的判讀帶來了不便的影響，測定細菌吸光度值，具有定量準確、方法簡便及重復性好等優(yōu)點。

通過表2可以看出，在20 μL菌量時，第1組的菌濃度為227×1010個·L－1，遠遠低于對照組5 017×1010個·L－1，抑制率為95.00%。同樣，在第2組里，只有24×1010個·L－1個細菌。這可能是因為藥物作用后，細菌崩解，破裂，胞質(zhì)流出，體積變小，減少了混濁度，從而減少了吸光度。這說明藥量在很少的情況下，都有很大的抑制效果。下一步做藥物對細菌外膜蛋白的提取時，選藥物質(zhì)量濃度為 29.0 g·L－1的即可。

［1］李春芬，李郁，魏建忠，等.安徽省部分地區(qū)鴨疫里氏桿菌的分離鑒定及生物學特性研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2009，31（3）：197－200.LI Chunfen，LI Yu，WEI Jianzhong，et al.Isolation and biological characterization of Riemerella anatipestifer in Anhui Province ［J］.J Chin J Prev Vet Med，2009，31（3）：197－200.

［2］ TIMMS L M，MARSHALL R N.Laboratory assessment of protection given by experiment pasteurella-anatipestifer vaccine［J］.J British Vet，1989，145：483－493.

［3］ SANDHU T S.Immunization of white pekin ducklings against Pasteurella anatipestifer infection［J］.J Avian Dis，1979，23：662－669.

［4］ SUBRAMANIAM S，HUANG B，LOH H.Characterization of a predominant immunogenic outer membrane protein of Riemerella anatipestifer ［J］.J Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（2）：168－174.

［5］張大丙，郭玉璞.鴨疫里默氏菌血清型的研究概況［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，11（42）：38－40.ZHANG Dabing，GUO Yupu.Development of the research on Riemerella anatipestifer ［J］.J Chin J Vet Med，2006，11（42）：38－40.

［6］程安春，汪銘書，陳孝躍，等.我國鴨疫里默氏桿菌血清型調(diào)查及新血清型的發(fā)現(xiàn)和病原特性［J］.中國獸醫(yī)學報，2003，23（4）：320－323.CHENG Anchun，WANG Mingshu，CHEN Xiaoyue，et al.Epidemiology and new serotypes of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in China and studies on their pathogenic characteristics ［J］.J Chin J Vet，2003，23（4）：320－323.

［7］劉穎.鴨疫里默氏菌耐藥性監(jiān)測與分析［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2005.LIU Ying.Surveillance and Analysis on the Antibiotic Resistance of Riemerella Anatipestifer［D］.Beijing：China Agricultural University，2005.

［8］張先福.中藥防治鴨疫里氏桿菌病的組方篩選及其抗菌機制的初步研究［D］.浙江：浙江大學，浙江省農(nóng)業(yè)科學院，2006.ZHANG Xianfu.Screening of Chinese Herbal Medicine Against Riemerella Anatipestifer Disease and the Preliminary Study of Antibacterial Mechanism ［D］.Hangzhou：Zhejiang University，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，2006.

［9］楊小林，劉國平，龔大春，等.鴨里氏桿菌的分離鑒定及生物學特性［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2006，9（45）：5.YANG Xiaolin，LIU Guoping，GONG Dachun，et al.Isolation and Identification of Riemerella Anatipestifer ［J］.J Hubei Agric Sci，2006，9（45）：5.

［10］羅如松，郭愛珍，林荔雯，等.豬胸膜肺炎放線桿菌濁度與細菌計數(shù)的關(guān)系［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37（10）：10－12.LUO Rusong，GUO Aizhen，LIN Liwen，et al.Relationship between the optical density and bacterial count of swine Actinobacillus pleuropneumoniae ［J］.J Anim Husb Vet Med，2005，37（10）：10－12.

［11］沈萍.微生物學實驗［M］.3版.北京：高等教育出版社，2001.

［12］胡詠梅.教育統(tǒng)計學與SPSS軟件應用［M］.北京：北京師范大學出版社，2001.

［13］胡清海，陳鴻軍，劉曉文，等.鴨疫里氏桿菌生長曲線的測定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2002，34（8）：8－9.HU Qinghai，CHEN Hongjun，LIU Xiaowen，et al.Determination of growth curve of Riemerlla anatipestifer［J］.J Anim Husb Vet Med，2002，34（8）：8－9.

［14］王嵩.中草藥抗細菌感染的研究［J］.北京中醫(yī)雜志，2002，21（4）：249－250.WANG Song.Chinese herbal anti-bacterial infection ［J］.J Beijing J Trad Chin Med，2002，21（4）：249－250.