厚樸AFLP分子標記體系的建立

蔣燕鋒，斯金平，黃華宏，程龍軍

（浙江林學院 林業(yè)與生物技術學院，浙江 臨安311300）

中藥材厚樸為木蘭科Magnoliaceae植物厚樸Magnolia officinalis或凹葉厚樸M.officinalis var.biloba的干燥干皮、枝皮和根皮［1］。前者主要分布于四川、湖北等省，稱為“川樸”，其葉型為小凸尖葉；后者主產(chǎn)于湖南、浙江、廣西、福建等省，稱為“溫樸”，其葉型為凹葉。兩者之間還有許多在葉形上呈中間狀態(tài)的過渡類型。厚樸是中國特有的常用中藥材，長期以來主要利用野生資源。一方面因資源過度消耗，日益枯竭，另一方面因利用野生資源而導致品質參差不齊，嚴重制約了厚樸藥材現(xiàn)代化國際化進程。厚樸因其特殊的分類地位和資源的日益枯竭而先后被列為國家珍稀瀕危植物和二級保護中藥材。厚樸中藥材的質量控制和品質評價對保護和發(fā)展厚樸資源，滿足中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化和國際化的要求尤為重要。擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）是限制性片斷長度多態(tài)性（RFLP）技術和聚合酶鏈式反應（PCR）技術的結合。AFLP標記具有不需要預先知道基因組背景、多態(tài)位點豐富、靈敏度高和重復性好等優(yōu)點，克服了RFLP檢測位點有限和隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）不穩(wěn)定等缺點［2］。AFLP問世后便在樹木的數(shù)量性狀定位、種質資源鑒定、遺傳連鎖圖譜構建、群體遺傳結構及多樣性研究、演化和親緣關系研究等方面得到了廣泛的應用［3－8］，而對于厚樸來說，目前僅有郭寶林等［9］利用 RAPD技術探討了厚樸種內(nèi)關系和道地性問題。筆者以不同類型厚樸為試材，對實驗過程中影響AFLP分析的酶切、連接、預擴增及選擇性擴增的各個環(huán)節(jié)依次進行了優(yōu)化，最終建立了適合厚樸的較為理想的AFLP分析體系。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)已有厚樸研究，于9月下旬至10月上旬（厚樸種子成熟期）在湖北鶴峰、浙江景寧、廣西資源等3個分別代表小尖葉型、中間型及凹葉型的種源地種子，去掉外果皮后濕沙混藏。初春播種育苗于浙江林學院林木遺傳育種科研苗圃。

采集正常生長的嫩葉，用冰壺帶回實驗室，液氮速凍后置－70℃冰柜保存。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制備與檢測 實驗采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）-硅珠吸附法［10］提取不同樣品的厚樸葉片DNA，用NanoDrop微量分光光度計（ND-1000）測定DNA的純度和濃度。同時每個樣品取5 μL，加1 μL上樣緩沖液混合后，于10.0 g·L－1瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)（Gel DocTM，Bio-Rad）下觀察并照相。

1.2.2 DNA的酶切與連接 酶切反應采用EcoR I和Mse I雙酶切組合，參考白樺Betula platyphylla基因組雙酶切體系［11］略作修改。厚樸的酶切體系為EcoR I（20×16.67 mkat·L－1，NEB）0.15 μL，Mse I（10×16.67 mkat·L－1，NEB）0.30 μL，10×NEB buffer 5.00 μL，100×牛血清蛋白（BSA）0.30 μL，加雙蒸水至 25.00 μL。模板DNA用量為100～700 ng，在 37℃ 水浴酶切 1～6 h后放入 75℃ 水浴15 min，使酶失活后，立即置于冰上冷卻。取 5.00 μL反應液與 1.00 μL上樣緩沖液混合，于10.0 g·L－1瓊脂糖膠凝膠電泳檢測。連接體系 25.00 μL，含酶切產(chǎn)物 20.00 μL，T4 Ligase（400×16.67 mkat·L－1，NEB）0.10 μL，EcoR I 接頭（E 接頭，10.0 μmol·L－1）0.50 μL，Mse I接頭（M 接頭，10.0 μmol·L－1）1.00 μL，10×buffer 2.00 μL，雙蒸水 1.40 μL。16℃ 連接過夜。接頭序列如下：

1.2.3 預擴增反應 預擴增反應體系：連接產(chǎn)物2.00 μL，Taq DNA聚合酶（5×16.67 mkat·L－1，NEB）0.20 μL，E ＋ A 引物（50 mg·L－1）1.00 μL，M ＋ C 引物（50 mg·L－1）1.00 μL，三磷酸脫氧核苷酸 dNTPs（2.5 mmol·L－1，TaKaRa）1.60 μL，10×PCR buffer 2.00 μL，加雙蒸水至 20.00 μL。預擴增在 ABI9700 PCR儀上進行。反應程序為：94℃預變性2 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；最后 72℃ 延伸 5 min，4℃ 保持。取 5.00 μL預擴增產(chǎn)物與 1.00 μL上樣緩沖液混合后于 15.0 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳檢測預擴增效果。

1.2.4 選擇性擴增反應及其優(yōu)化 選擇性擴增的好壞直接關系銀染效果的好壞，因此，選擇擴增的優(yōu)化至關重要。預擴增產(chǎn)物稀釋一定倍數(shù)后進行選擇性擴增，選擇性堿基數(shù)為3。反應體系為：稀釋后的預擴增產(chǎn)物 2.00 μL，Taq DNA 聚合酶（5×16.67 mkat·L－1，NEB）0.20 μL，E ＋ ANN 引物（20 mg·L－1）0.30 μL，M+CNN 引物（20 mg·L－1）1.80 μL，dNTPs（2.5 mmol·L－1，TaKaRa）1.60 μL，Mg2+（25.0 mmol·L－1）1.00 μL，10×PCR buffer 2.00 μL，加雙蒸水到20.00 μL。預擴增在 ABI9700 PCR儀上進行。反應程序為：94℃預變性 2 min；94℃30 s，65℃ 30 s（以后降低 0.7℃·循環(huán)-1），72℃1 min，13個循環(huán)；然后在退火溫度 56℃，其余條件不變的情況下，再進行23循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保持。在此基礎上，我們從4個因素的多個水平進行選擇性擴增的優(yōu)化（表1），4個因素逐一優(yōu)化，且一個因素優(yōu)化后的結果在后續(xù)因素的優(yōu)化過程中固定下來。

1.2.5 PAGE電泳及銀染檢測 反應結束后，選擇性擴增產(chǎn)物與上樣緩沖液（體積分數(shù)為98%甲酰胺；10.0 mmol·L－1乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0； 體積分數(shù)為0.25% 溴酚藍； 體積分數(shù)為0.25% 二甲苯青）等體積混合，95℃6 min后迅速將PCR管置于冰上以保持變性狀態(tài)，然后置于－20℃冰箱用于后續(xù)的電泳檢測。本實驗中采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染的方法進行檢測［12］。銀染后的板晾干后在膠片觀察燈下觀察，選擇那些具有清晰條帶的引物作為AFLP反應的最佳引物。

表1 選擇性擴增各因素處理方案Table 1 Different treatments of selective amplification factors

2 結果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測

CTAB-硅珠吸附法提取的厚樸葉片DNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶十分清晰明亮且無拖尾、背景干擾等現(xiàn)象（圖1），表明蛋白質等雜質去除較干凈，純度較高。經(jīng)測定，吸光度D260/D280比值在1.8左右，但質量濃度相對較低，在90.0 mg·L－1左右。

圖1 CTAB硅珠法提取的DNA的瓊脂糖電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of DNA extracted by CTAB-SiO2method

2.2 AFLP反應體系的優(yōu)化

本實驗分別用100～600 ng不同樣品的DNA進行酶切、連接、預擴增和選擇性擴增，結果在15.0 g·L－1的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。以湖北五峰種源的厚樸為例（下同），擴增條帶絕大部分為100～750 bp，且400 bp左右較為明亮（圖2）。最后經(jīng)60.0 g·L－1變性聚丙酰胺變性膠電泳，發(fā)現(xiàn)DNA濃度的不同沒有導致DNA條帶多寡的變化，而且條帶的清晰度也差別不大，因此考慮DNA使用量居中，為400 ng。

圖2 不同DNA用量對選擇性擴增結果的影響Figure 2 Effect of different DNA treatments on selective amplification result

預擴產(chǎn)物的用量對選擇性擴增結果有重要影響。實驗中湖北五峰種源的厚樸DNA經(jīng)酶切、連接和預擴后，預擴產(chǎn)物分別按1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60進行稀釋，選擇性擴增后在15.0 g·L－1瓊脂糖凝膠上電泳檢測。發(fā)現(xiàn)稀釋倍數(shù)為20，30和40倍時，條帶較清楚且較明亮，在200～300 bp之間明亮度最高，片段擴增量較多（圖3）。而30稀釋倍數(shù)是其中條帶清晰度和明亮度是最好的，故實驗選用30稀釋倍數(shù)。

dNTPs，Mg2+和Taq DNA聚合酶是影響擴增效果的關鍵因素。不同物種的AFLP分析中，dNTPs，Mg2+，Taq DNA聚合酶的最適濃度會有所不同。

體系中的dNTPs是PCR反應的原料物質，是反應必不可少的組分之一。厚樸研究發(fā)現(xiàn)，體系中不同dNTP的濃度對擴增結果沒有顯著影響，但濃度增加可稍微提高擴增產(chǎn)物的得率（圖4）。因此，綜合考慮試驗成本和擴增效率，選擇厚樸AFLP選擇性擴增中 dNTP濃度為0.225 mmol·L－1。

圖3 不同稀釋倍數(shù)預擴增產(chǎn)物的選擇性擴增結果Figure 3 Different selective amplification results with different dilution multiple of pre-amplification products

圖4 不同dNTPs濃度對選擇性擴增的影響Figure 4 Effect of dNTPs concentration on selective amplification result

Mg2+可以影響酶的活性、擴增的真實性以及產(chǎn)物的特異性，故Mg2+濃度也是反應中不可或缺的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，隨著Mg2+的濃度的增加，擴增也越來越清晰。而當Mg2+的濃度達到2.25 mmol·L-1時，出現(xiàn)了非特異性擴增，Mg2+會與dNTP結合而影響擴增效率（圖5）。因此，厚樸AFLP選擇性擴增體系中Mg2+的濃度為2.00 mmol·L-1。

Taq DNA聚合酶在擴增體系中起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，聚合酶為8.34～33.34 nkat時擴增產(chǎn)物相對較集中，且隨著酶的增加，集中的 PCR產(chǎn)物帶較清晰；41.68 nkat時可能酶的使用量過大而出現(xiàn)非特異性擴增（圖6）。綜合考慮，確定 20.00 μL反應體系中Taq DNA聚合酶使用量為16.67 nkat。

圖5 不同Mg2+濃度對選擇性擴增的影響Figure 5 Effect of Mg2+concentration on selective amplification result

圖6 不同Taq DNA聚合酶用量的選擇性擴增結果Figure 6 Different treatments of Taq DNA enzyme on selective amplification result

2.3 厚樸AFLP優(yōu)化反應體系的驗證

為了驗證上述實驗獲得的厚樸AFLP優(yōu)化體系的可靠性，我們對不同的厚樸樣品使用E-ACA+M-CAT引物對進行選擇性擴增，擴增產(chǎn)物進行變性聚丙烯酰胺凝膠泳檢測（圖7）。結果表明，不同樣品條帶清晰，說明優(yōu)化的AFLP體系能產(chǎn)生較為理想的結果，這為AFLP技術體系在厚樸種質資源鑒定、遺傳連鎖圖譜構建、群體遺傳結構及多樣性研究、演化和親緣關系研究等方面的應用奠定了基礎。

圖7 不同樣品E-ACA+M-CAT引物選擇性擴增電泳圖Figure 7 An electrophoretogram of different samples’selective amplification result with the primer E-ACA and M-CAT

因此，采用CTAB硅珠法提取的DNA質量較好，適用于AFLP分析。酶切的基因組DNA以400 ng為宜，37℃條件下酶切時間為6 h較理想；預擴增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)以20倍為宜；20.00 μL選擴反應體系中 Mg2+濃度為2.00 mmol·L-1，dNTPs濃度為0.225 mmol·L-1，Taq DNA 聚合酶用量為16.67 nkat，擴增帶清晰且穩(wěn)定，擴增效果較理想，可以獲得清晰的AFLP指紋圖譜。

3 討論

AFLP技術程序多且復雜，從基因組DNA的提取到電泳銀染每個環(huán)節(jié)都必須嚴格要求，才能獲得最佳的結果。模板DNA的質量和完全酶切是AFLP試驗成敗的關鍵。實驗證明，用CTAB-硅珠吸附法提取的厚樸DNA質量符合AFLP技術要求。酶切時模板以400 ng為宜，酶切時間為6 h。預擴增是一承上啟下的步驟，既可以檢測酶切和連接的效果，又可以對選擇性擴增模板起到純化的作用。預擴產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)對于選擇性擴增的成敗非常重要，幾個稀釋梯度的瓊脂糖電泳譜帶差別不大，在垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳后稀釋30倍的電泳譜帶清晰，便于讀取，其他稀釋倍數(shù)下的擴增條帶數(shù)目少、不清晰且擴增結果不穩(wěn)定。Taq酶的價格比較高，摸索適當?shù)拿赣昧?，對試驗效果及?jié)約成本都大有益處。AFLP步驟多而且聯(lián)系密切，因此，建議在厚樸AFLP分析時，每完成一步，最好取少量樣品在瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，得到預期效果后再進行下一步試驗。這樣既節(jié)省時間，又不浪費試劑。

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