反相高效液相色譜法測定犬血漿中靛玉紅的質(zhì)量濃度

童立年

(浙江省舟山醫(yī)院，浙江 舟山 316000)

靛玉紅是從中藥青黛中提取的雙吲哚類化合物，對慢性粒細(xì)胞白血病具有明顯的抑制作用[1-3]，具有臨床療效可靠、毒副作用小、對骨髓無明顯抑制作用等特點。筆者以非那雄胺為內(nèi)標(biāo)，建立了靈敏的反相高效液相色譜法測定Beagle犬血漿中靛玉紅的含量，旨在為靛玉紅的藥代動力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

2010 C型高效液相色譜儀(日本島津);BP 210 S型萬分之一電子天平(德國賽多利斯);TGL 216 C型臺式高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW-80型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)實驗儀器廠)。靛玉紅對照品(中國藥品生物制品檢定所);非那雄胺(武漢合中化工生物有限公司);甲醇(色譜純，美國Fisher公司);水為重蒸水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

稱取靛玉紅對照品及非那雄胺適量，分別用二甲基亞砜(DMSO)和甲醇溶解制備成約含靛玉紅80 mg/L及非那雄胺100 mg/L的對照品貯備液，將上述兩種溶液貯存于-4℃冰箱中，臨用前用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2.2 血樣制備與測定方法

精密量取Beagle犬血漿樣品0.5 mL，加入甲醇50 μL及內(nèi)標(biāo)非那雄胺甲醇溶液50 μL，旋渦混勻，加入混合溶劑正庚烷-乙醚(75 ∶25，V/V)3.5 mL，旋渦 5 min，以 10000 r/min 離心 5 min。分取有機相于另一離心管中，于50℃水浴中以氮氣流吹干。殘渣用100 μL流動相復(fù)溶，旋渦 3 min，以 10000 r/min離心 2 min。取上清液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，以內(nèi)標(biāo)法計算血漿中靛玉紅的質(zhì)量濃度。

2.3 色譜條件與專屬性考察

色譜柱:Hypersil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測波長:286 nm;流動相:0.1 mol/L的醋酸銨(含0.5%冰醋酸)-甲醇(25∶75);流速:1 mL/min;柱溫:35℃。在此條件下，靛玉紅出峰時間在11 min左右，內(nèi)標(biāo)出峰時間在6 min左右;主峰和內(nèi)標(biāo)峰峰形良好，相鄰物質(zhì)峰間可完全分離(R＞1.5)，血漿中內(nèi)源性成分對測定無干擾，滿足樣品分析檢測要求。色譜圖見圖1。

2.4 分析方法驗證

圖1 高效液相色譜圖

線性范圍、檢測限及定量限:取0.5 mL空白犬血漿，分別加入不同質(zhì)量濃度的靛玉紅對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，使每1 mL血漿中分別含靛玉紅 0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 μg/mL，混勻后依法萃取、測定，記錄色譜圖。以峰面積比(A樣/A內(nèi))為縱坐標(biāo)、靛玉紅質(zhì)量濃度 C(g/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y=1.013 X+0.027，r2=0.9997(n=7)。結(jié)果表明，靛玉紅質(zhì)量濃度在0.010～0.800 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積比線性關(guān)系良好，最低檢測限為5 ng/mL(S/N≥3)，最低定量限為10 ng/mL。

萃取回收率:取空白犬血漿0.5 mL，依法分別配制成高、中、低3 種質(zhì)量濃度(0.400，0.100，0.025 μg/mL)的靛玉紅血漿樣品(C r)，按2.2項血漿樣品制備法處理后進(jìn)樣3次，測得峰面積，并求出各質(zhì)量濃度下3次進(jìn)樣的峰面積均值 A r。另取高、中、低已知質(zhì)量濃度(C s)的靛玉紅對照品甲醇溶液，氮氣揮干，加入100 μL流動相溶解后進(jìn)樣20 μL測定，得峰面積 A s。以前后兩種處理測定得到的對照品峰面積之比(A r/A s)計算萃取回收率。結(jié)果平均萃取回收率為71.65%，RSD為6.78%(n=9)。

精密度及方法回收率:取空白犬血漿0.5 mL，分別配制高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的血漿樣品，照2.2項下方法分別在同一日內(nèi)測定5次和每日5次連續(xù)測定3 d，考察日內(nèi)、日間精密度和回收率。結(jié)果見表1。

表1 精密度和方法回收率試驗結(jié)果(n=5)

樣品穩(wěn)定性:取空白犬血漿0.5 mL，分別配制高、中、低3種不同質(zhì)量濃度(0.400，0.100，0.025 μg/mL)的血漿樣品，于冰箱 -20℃放置，在不同時間取樣，按2.2項下方法進(jìn)行穩(wěn)定性考察。結(jié)果血漿樣品中靛玉紅在15 d內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

關(guān)于靛玉紅血藥濃度的測定方法文獻(xiàn)報道很少。李長玲等[4]采用放射性標(biāo)記法，但操作復(fù)雜，設(shè)備要求高，且測定結(jié)果實為靛玉紅及其代謝產(chǎn)物的放射性之和。李珂佳等[5]用丙酮直接沉淀蛋白的方法對大鼠血漿中靛玉紅質(zhì)量濃度進(jìn)行了測定，但定量限為0.025 μg/mL。筆者所建立的反相高效液相色譜法，通過對犬空白血樣的干擾分析、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇以及色譜條件與操作方法的研究，提高了靈敏度，方法學(xué)考察結(jié)果顯示能滿足生物樣品測定的要求，這為靛玉紅進(jìn)一步的藥代動力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]劉 佳，曾 琛，胡蘭萍，等.靛玉紅對慢性髓性白血病K562細(xì)胞增殖的抑制作用[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，15(2):10-12.

[2]吳琦瑋，葛忠良，高 月，等.靛玉紅對腫瘤細(xì)胞抑制作用的研究及相關(guān)機制探討[J].天津中醫(yī)藥，2008，25(1):55-58.

[3]吳正紅，周 靜，平其能，等.靛玉紅磷脂復(fù)合物的跨膜轉(zhuǎn)運及其犬體內(nèi)藥代動力學(xué)[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2007，38(4):327-331.

[4]李長玲，籍秀娟.靛玉紅及其乙基和十八烷基衍生物在動物體內(nèi)命運的比較[J].藥學(xué)學(xué)報，1983，18(5):332-338.

[5]李珂佳，蔣學(xué)華.RP-HPLC測定大鼠靜脈注射靛玉紅后的血藥濃度[J]. 華西藥學(xué)雜志，2007，22(3):333-334.