SEA體內(nèi)殺傷S180肉瘤效果及其細(xì)胞因子的測(cè)定*

張 云 孫嘉琳 王 雪 馮艷敏 李政楠 張洪娜

目前研究的金黃色葡萄球菌腸毒素A（即超抗原SEA）誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)大的殺傷作用[1]。在臨床實(shí)踐中需要能對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷的治療方法，而可選擇性地與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的抗體的出現(xiàn)為腫瘤的生物治療提供了新的選擇[2]。SEA抗腫瘤細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)有很多報(bào)道，并被證實(shí)存在一定的殺傷效果[3]，而小鼠體內(nèi)腫瘤模型的成功建立為SEA體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的研究提供了便利的條件。本研究利用SEA對(duì)小鼠的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療，證實(shí)了SEA的體內(nèi)殺傷效果，并探討其殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Balb/c雄性小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào) SCXK－（軍）－2002－001。隨機(jī)分成 4組，SEA 低劑量組（0．05 mg/kg），SEA 中劑量組（0.25 mg/kg），SEA 高劑量組（0.5 mg/kg）和生理鹽水對(duì)照組，每組10只，前3組為實(shí)驗(yàn)組。S180細(xì)胞為天津科技大學(xué)食品學(xué)院饋贈(zèng)。SEA為本實(shí)驗(yàn)提取，生理鹽水注射液、干擾素（IFN）-γ鼠單克隆抗體購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司，山羊抗小鼠SP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海西塘科技有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海麥莎生物科技有限公司，蘇木素染色液購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司，IFN-γ ELISA試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腫瘤模型的建立 取凍存復(fù)蘇的S180細(xì)胞株在5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳2～3代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘤細(xì)胞，用生理鹽水稀釋成1×107/mL的瘤細(xì)胞懸液,取其中0.2 mL對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，10 d后，抽取小鼠腹水細(xì)胞。腹水細(xì)胞傳2～3代后，抽取離心，用生理鹽水洗2次，并稀釋成1×107/mL的瘤細(xì)胞懸液，以每只小鼠0.2 mL接種于小鼠右前腋皮下。接種24 h后開始給藥，實(shí)驗(yàn)組每鼠腹腔注射0.2 mL相應(yīng)濃度的SEA，對(duì)照組注射等量生理鹽水，隔天給藥共4次。

1.2.2 腫瘤體積測(cè)量 接種后第5天，用游標(biāo)卡尺開始測(cè)量腫瘤大小，連續(xù)測(cè)量5 d，并記錄下數(shù)據(jù)。

1.2.3 免疫組化法檢測(cè)組織中細(xì)胞因子IFN-γ的分布情況 給藥第8天，解剖小鼠并取下腫瘤組織，甲醛溶液固定，石蠟包埋，切5 μm厚的切片，組織脫蠟至水。在組織切片上滴加3%H2O2溶液，孵育15 min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的干擾;蒸餾水稍洗后，PBS洗5 min；滴加血清封閉液，孵育15min，甩去封閉液，滴加一抗，37℃孵育3 h，然后按二抗試劑盒說(shuō)明書滴加各工作液，DAB顯色，稍洗后，蘇木精染色，自來(lái)水沖洗，鹽酸乙醇分化20 s。70%乙醇30 s→80%乙醇30 s→95%乙醇Ⅰ2 min→95%乙醇Ⅱ2 min→100%乙醇Ⅰ3 min→100%乙醇Ⅱ3 min→二甲苯Ⅰ透明7 min→二甲苯Ⅱ透明7 min→中性樹膠封片。顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.2.4 ELISA法測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ指標(biāo) 于末次給藥后24h，眼眶靜脈叢取血，每只小鼠取0.2 mL，離心，取上清，并取出腫瘤組織和脾臟，稱質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率和脾臟指數(shù)。腫瘤抑制率（%）＝（對(duì)照組腫瘤質(zhì)量－實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量）/對(duì)照組腫瘤質(zhì)量；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。用 PBS溶液溶解，采用酶標(biāo)雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清、腫瘤和脾臟中IFN－γ的水平。按試劑盒說(shuō)明書加標(biāo)準(zhǔn)品及上清液，加相應(yīng)的多克隆抗體，37℃孵育60 min，洗滌后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的抗體，再次孵育，洗滌后加顯色劑，終止反應(yīng)，492 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出血清樣本IFN－γ含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性分析，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法進(jìn)行q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Balb/c小鼠瘤體積及生長(zhǎng)曲線 SEA組實(shí)體瘤體積均比生理鹽水對(duì)照組瘤體積增長(zhǎng)緩慢，其中SEA高劑量組與對(duì)照組腫瘤體積相差最多，見圖1。

2.2 各組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)比較 見表1。與對(duì)照組比較，SEA中劑量組和SEA高劑量組腫瘤質(zhì)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而SEA各組脾臟指數(shù)反而上升，除低、中劑量組外，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且各組間隨著SEA劑量的增大，脾臟指數(shù)增加，腫瘤質(zhì)量減少。腫瘤組織中IFN-γ的分布情況見圖2。與對(duì)照組比較，SEA各劑量組血清中IFN-γ 均明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0．05）。并且SEA低劑量組分別與SEA中劑量和SEA高劑量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。SEA高劑量組的抑瘤率高于低、中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），低、中劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 解剖后各組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)比較（n＝10±s）

表1 解剖后各組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)比較（n＝10±s）

觹P ＜ 0．05，觹觹P ＜ 0．01

組別對(duì)照組①SEA低劑量組②SEA中劑量組③SEA高劑量組④F q①∶②①∶③①∶④②∶③②∶④③∶④0.298 7.513**7.215**腫瘤質(zhì)量（g）0.816±0.030 0.797±0.017 0.784±0.021 0.457±0.022 561.303**2.610 4.396*49.313**1.786 46.703**44.918**脾臟指數(shù)（mg/g）10.317±0.742 16.310±2.854 23.270±1.895 27.517±2.562 35.906**5.074 10.968*14.564**5.893 9.489*3.596 IFN－γ（ng/L）28.431±12.167 34.423±7.828 49.402±3.810 58.674±7.723 37.915**3.918*13.715*19.778**9.797*15.860**8.725**抑瘤率（%）-2.33±1.95 3.92±2.12 44.00±3.21 931.740**---

3 討論

干擾素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子家族,其功能主要包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞分化、抑制血管生成等[4]。IFN-γ主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，在小鼠，由Th1亞群產(chǎn)生。當(dāng)抗原刺激后T細(xì)胞分泌IFN-γ，通常與IL-2的產(chǎn)生相一致。干擾素作為具有較強(qiáng)抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子[5],在腫瘤生物治療中占據(jù)了較為重要的位置。相信隨著對(duì)干擾素生理活性和作用機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，可以進(jìn)一步提高其臨床治療效果，在腫瘤治療領(lǐng)域也將具有更廣闊的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SEA組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度明顯低于生理鹽水對(duì)照組，治療結(jié)束后SEA組腫瘤質(zhì)量及瘤體積明顯低于對(duì)照組，表明SEA可以抑制S180腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。且腫瘤的生長(zhǎng)情況與SEA的劑量有關(guān)，隨劑量的增大而呈下降趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)中，脾臟指數(shù)卻隨SEA劑量的增大呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，說(shuō)明SEA殺傷腫瘤的效果與T細(xì)胞的激活有關(guān)，從ELISA實(shí)驗(yàn)中測(cè)得血清中IFN－γ的水平可以看出，腫瘤細(xì)胞死亡的原因在于T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN－γ大量增多，說(shuō)明超抗原SEA可刺激機(jī)體產(chǎn)生殺傷性很強(qiáng)的細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）及大量的細(xì)胞因子，對(duì)腫瘤具有很強(qiáng)的殺傷作用。它們能與多數(shù)T細(xì)胞結(jié)合并為T細(xì)胞活化提供信號(hào)，而普通抗原只能與少數(shù)對(duì)應(yīng)T細(xì)胞結(jié)合并使之活化[6]。但是由于極微量的超抗原就可激活大量T細(xì)胞并大量分泌細(xì)胞因子，因此如果在應(yīng)用時(shí)劑量掌握不準(zhǔn)，就有可能引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂而產(chǎn)生超敏反應(yīng)，導(dǎo)致一系列急慢性疾病的發(fā)生，如毒素中毒綜合征、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕熱、川崎病和非特異性皮炎等。超抗原殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也有殺傷作用[7]。對(duì)SEA細(xì)胞靶向定位殺傷腫瘤細(xì)胞技術(shù)還有待進(jìn)一步研究，進(jìn)而降低SEA的不良反應(yīng)。

同時(shí)對(duì)于SEA是否能促進(jìn)其他因子的分泌，分泌的IFN-γ等細(xì)胞因子通過哪條途徑作用于腫瘤細(xì)胞等還有待于深入研究，以利用其機(jī)制進(jìn)一步提高其抗腫瘤潛能的途徑和方法；最后,通過基因重組的方法對(duì)干擾素蛋白進(jìn)行改造[8]，可提高其生物學(xué)活性，并降低不良反應(yīng)。

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[3] 許桂蓮，朱錫華,楊勁，等.超抗原SEA誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能的作用機(jī)制探討[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2002,18(6):105-107.

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