產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的生長(zhǎng)代謝特性

劉 楓，李建政，昌 盛，陳忠林

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150090，blist@126.com)

產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的生長(zhǎng)代謝特性

劉 楓，李建政，昌 盛，陳忠林

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150090，blist@126.com)

為了對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體的擴(kuò)大培養(yǎng)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，采用靜態(tài)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，考察了碳源、氮源、溫度和pH等因素對(duì)前期分離得到的新型共培養(yǎng)體7-m-2a的生長(zhǎng)代謝特性的影響.結(jié)果表明，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a對(duì)丙酸、丁酸和苯甲酸都具有很高的轉(zhuǎn)化率，其最適宜碳源為丁酸，不易利用葡萄糖和蔗糖;以蛋白胨和酵母粉混合物為氮源時(shí)，其生長(zhǎng)代謝活動(dòng)最旺盛，適宜的pH和溫度分別為8.0和45℃.

厭氧消化;產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌;互營(yíng)共培養(yǎng)體;生理生態(tài)特性

在參與厭氧消化的各微生物類群中，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群在營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位上位于產(chǎn)酸發(fā)酵菌群和產(chǎn)甲烷菌群之間，能將產(chǎn)酸發(fā)酵菌群代謝產(chǎn)生的丙酸、丁酸等揮發(fā)性有機(jī)酸(VFAs)和乙醇等進(jìn)一步降解轉(zhuǎn)化為乙酸和CO2/H2，為后續(xù)的產(chǎn)甲烷菌群提供了可以直接利用的底物［1－4］.研究表明，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群的生態(tài)位比產(chǎn)甲烷菌群的更加狹窄，生長(zhǎng)和代謝速度更慢、而且生長(zhǎng)條件更加苛刻，對(duì)厭氧消化進(jìn)程具有顯著的限制作用.同時(shí)，在一定的負(fù)荷范圍內(nèi)，產(chǎn)甲烷菌群的生物量和代謝強(qiáng)度是受產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群代謝產(chǎn)物的控制.因此，提高產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體的功能作用，將會(huì)有效提高厭氧生物處理系統(tǒng)的處理效能和運(yùn)行穩(wěn)定性［5］.然而，目前所報(bào)道的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌株很少，對(duì)其生理生態(tài)習(xí)性的了解也不夠深入和廣泛［ 4，6－9］.本文將對(duì)前期研究中分離篩選出的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a進(jìn)行研究，以考察其在不同碳源、氮源和pH及溫度等條件下的生理生態(tài)學(xué)特性，以期為在厭氧生物處理系統(tǒng)中富集更多的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和工程應(yīng)用提供指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養(yǎng)基

產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a是課題組前期以厭氧活性污泥為出發(fā)菌群選育得到的，利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)其菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果顯示此共培養(yǎng)體中含有專性的互營(yíng)產(chǎn)乙酸菌Desulfotomaculum sp.Iso－W2及其伴生菌，其中的伴生菌是能利用甲酸鹽和H2/CO2的Uncultured bacterium 054E12－B－DI－P58和Sedimentibacter sp.JN18－A14－H［10］.實(shí)驗(yàn)采用的基本培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)［10］.在進(jìn)行不同碳源(有機(jī)物)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)，在培養(yǎng)基基本成分的基礎(chǔ)上，分別加入丙酸鈉、丁酸鈉、苯甲酸、葡萄糖、蔗糖，加入量均為10.0 g.在進(jìn)行不同氮源對(duì)7-m-2a生長(zhǎng)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸能力影響試驗(yàn)時(shí)，以丁酸鈉培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，更換不同氮源，1 L培養(yǎng)基的加入量為3.0 g，其他成分同基本培養(yǎng)基.

1.2 靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方法

向50 mL血清瓶中注入30 mL培養(yǎng)基，充氮脫氧，滅菌;從厭氧固體培養(yǎng)基上挑取少量的7-m-2a菌落配制成菌懸液，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)為1.3×108個(gè)/mL.用1 mL無菌注射器接種，接種量為1 mL.接種后置于空氣浴中在35℃和110 r/min下培養(yǎng)，5 d后，取樣分析氣體成分、揮發(fā)酸和細(xì)胞生長(zhǎng)等指標(biāo).實(shí)驗(yàn)分4組，分別考察碳源、氮源、pH及溫度對(duì)7-m-2a生長(zhǎng)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝的影響，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣，相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)取平均值.

1.3 分析方法

發(fā)酵氣體積采用玻璃注射器計(jì)量，其組分采用氣相色譜儀(SP－6801T，山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)分析［11］.液相末端發(fā)酵產(chǎn)物(VFAs和乙醇)的分析，采用另一臺(tái)氣相色譜儀(SP－ 6890，山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)測(cè)定［11］.菌懸液細(xì)胞密度的測(cè)定采用分光光度法［11］.pH的值測(cè)定采用PHS－25型酸度計(jì)測(cè)，苯甲酸含量測(cè)定采用紫外分光光度法［11］.

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對(duì)7-m-2a生長(zhǎng)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示，碳源的選擇對(duì)互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a生長(zhǎng)的影響較大.以丁酸為底物時(shí)，7-m-2a生長(zhǎng)最旺盛，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，其吸光度(OD)和乙酸產(chǎn)量分別高達(dá)0.51 mg/L和1 644 mg/L.適宜的碳源其次是苯甲酸和丙酸，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，其OD和乙酸質(zhì)量濃度分別為0. 26，0. 20，1 383，1 063 mg/L.而以葡萄糖、蔗糖為底物時(shí)，7-m-2a只呈現(xiàn)微弱生長(zhǎng)，說明在7-m-2a中，優(yōu)勢(shì)菌株不易利用葡萄糖或蔗糖.從7-m-2a產(chǎn)氫能力分析，以丁酸為碳源時(shí)，其氫氣產(chǎn)量最高，為217 mL/L-培養(yǎng)基;其次是苯甲酸和丙酸，其氫氣產(chǎn)量分別可達(dá)157 mL/L-培養(yǎng)基和155 mL/L-培養(yǎng)基;在葡萄糖或蔗糖培養(yǎng)基中，7-m-2a的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸性能最差.以上現(xiàn)象表明，丁酸是最為合適的碳源，在之后的其他因素試驗(yàn)時(shí)，選擇丁酸作為碳源物質(zhì).

表1 碳源對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的影響

2.2 氮源對(duì)7-m-2a生長(zhǎng)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝的影響

氮源的性質(zhì)對(duì)不同微生物的增殖和代謝會(huì)產(chǎn)生不同的影響［12］.本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的氮源含量是3 g/L，如果采用2種氮源物質(zhì)，則每一種氮源物質(zhì)1.5 g/L;如果采用3種氮源物質(zhì)，則每一種氮源物質(zhì)各為1 g/L.共6組實(shí)驗(yàn):蛋白胨(P)、牛肉膏(B)、酵母粉(Y)、P+B、P+Y、P+B+Y(表2).

表2 氮源對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，以蛋白胨和牛肉膏組合為氮源時(shí)，7-m-2a生長(zhǎng)最旺盛，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，其OD值達(dá)到1.35.適宜7-m-2a生長(zhǎng)的氮源其次是蛋白胨和酵母粉組合，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的OD值為1.01.而單獨(dú)以酵母粉作為氮源時(shí)，7-m-2a生長(zhǎng)最弱，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的OD值僅達(dá)到0.34.從7-m-2a產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸效能分析，以蛋白胨和酵母粉為氮源時(shí)，其乙酸產(chǎn)量和氫氣產(chǎn)量分別高達(dá)1 510 mg/L和138 mL/L-培養(yǎng)基.其次是單獨(dú)以酵母粉作為氮源時(shí)，其乙酸產(chǎn)量和氫氣產(chǎn)量分別為1 337 mg/L和118 mL/L-培養(yǎng)基.利用蛋白胨和牛肉膏組合時(shí)，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸效能最差，但當(dāng)在此組合基礎(chǔ)上添加了酵母粉后，其乙酸和氫氣產(chǎn)量稍有上漲，分別達(dá)到了1 154 mg/L和113 mL/L-培養(yǎng)基.以上現(xiàn)象表明，酵母粉最適宜7-m-2a發(fā)揮產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸性能，蛋白胨最適宜7-m-2a的生長(zhǎng)繁殖;在兩者形成的組合試驗(yàn)中，其無論是對(duì)7-m-2a生長(zhǎng)繁殖的促進(jìn)，還是對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸效能的發(fā)揮，都是綜合效果最佳的.

2.3 pH值對(duì)7-m-2a生長(zhǎng)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝的影響

如表3所示，當(dāng)pH值為8時(shí)，7-m-2a的生長(zhǎng)最旺盛、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸效能最高.培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，其OD值達(dá)到1. 15，產(chǎn)乙酸量和產(chǎn)氫量也分別達(dá)到1 369 mg/L和131 mL/L-培養(yǎng)基.

表3 pH對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的影響

2.4 溫度對(duì)7-m-2a生長(zhǎng)和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸效能的影響

如表4所示，隨著溫度的改變，7-m-2a的生長(zhǎng)波動(dòng)幅度較大.在溫度為30℃時(shí)，其生長(zhǎng)量達(dá)到第一個(gè)峰值，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的OD值為1. 07，產(chǎn)乙酸量和產(chǎn)氫量也達(dá)到最大，分別為1 527 mg/L和180 mL/L-培養(yǎng)基;隨著溫度的上升，7-m-2a的生長(zhǎng)和代謝效能都有所減弱;當(dāng)溫度上升到45℃時(shí)，7-m-2a的生長(zhǎng)量達(dá)到第二個(gè)峰值，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)其OD值達(dá)到0. 99，產(chǎn)乙酸量和產(chǎn)氫量也分別達(dá)到1 675 mg/L和177 mL/L-培養(yǎng)基;之后隨著溫度的繼續(xù)上升，7-m-2a的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)幾乎停止.以上現(xiàn)象表明，7-m-2a在30℃和45℃下均能很好的進(jìn)行生長(zhǎng)代謝活動(dòng).由此推測(cè)，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a中可能存在著嗜中溫和中度嗜高溫兩類細(xì)菌.由于高溫條件下，菌體的代謝速率一般都比較快，所以選擇45℃為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的最佳培養(yǎng)溫度.

表4 溫度對(duì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的影響

3 結(jié)論

1)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a對(duì)于丙酸、丁酸和苯甲酸都有很高的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝能力，其最適宜碳源為丁酸，但不易利用葡萄糖和蔗糖.

2)以胰蛋白胨和酵母膏混合物為氮源時(shí)，互營(yíng)共培養(yǎng)體7-m-2a的生長(zhǎng)代謝活性最高，適宜的培養(yǎng)溫度為45℃，pH為8.0.

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Physioecologic and metabolic products characteristics of a new isolated syntrophic acetogenesis coculture 7-m-2a

LIU Feng，LI Jian-zheng，CHANG Sheng，CHEN Zhong-lin

(State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China，blist@126.com)

In order to culture the syntrophic acetogenesis coculture in large scale and make it be used in fullscale application，the effect of carbon source，nitrogen source，temperature and pH on the activity of a new isolated syntrophic acetogenesis cocluture 7-m-2a was investigated in this study.The result of batch cultivation experiments shows that the syntrophic acetogenesis coculture 7-m-2a can utilize propionate，butyrate and benzoate as carbon source，and the most appropriate substrate is butyrate，while it almost can not degrade glucose and sucrose.The metabolic activity is the most active when using the mixture of tryptone and yeast as nitrogen source.The suitable cultivation temperature and pH are 45℃and 8.0.

anaerobic digestion;syntrophic acetogenic bacteria;syntrophic cocluture;physioecologic characteristics

X703

A

0367－6234(2010)06－0890－03

2010－03－01.

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2009RFXXS004).

劉 楓(1984—)女，博士研究生;

李建政(1965—)男，教授，博士生導(dǎo)師.

(編輯 趙麗瑩)