高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的分離鑒定與脫氮性能

劉健楠，　汪　蘋，　尹明銳，　王　磊

(北京工商大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 北京　100048)

氮元素的嚴(yán)重超標(biāo)將引起水體的富營(yíng)養(yǎng)化及嚴(yán)重的生態(tài)環(huán)境污染等問題，因此，加強(qiáng)廢水脫氮研究就顯得尤為迫切[1-2]. 作為生物脫氮技術(shù)之一的好氧反硝化工藝與傳統(tǒng)的缺氧反硝化工藝相比具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[3]: 1) 細(xì)菌能在有氧條件下進(jìn)行反硝化，使硝化和反硝化能夠同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行,可以大大減少占地面積和建設(shè)資金.2)硝化的產(chǎn)物可直接作為反硝化作用的底物，避免了硝酸、亞硝酸的積累對(duì)硝化反應(yīng)的抑制，加速了硝化反硝化進(jìn)程. 且反硝化釋放出的OH-可部分補(bǔ)償硝化反應(yīng)所消耗的堿，能使系統(tǒng)中pH值相對(duì)穩(wěn)定. 3)在好氧脫氮過程中，進(jìn)水中的高濃度有機(jī)物直接成為脫氮所需的外界碳源，脫氮同時(shí)解決了高COD的問題. 近年來，新的研究發(fā)現(xiàn)，有些好氧反硝化菌往往也能進(jìn)行異養(yǎng)硝化，可以在有大量氧存在的條件下直接把氨氮轉(zhuǎn)化為脫氮產(chǎn)物而去除，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化已逐漸成為人們的研究熱點(diǎn)和重點(diǎn)[4-6]. 目前，文獻(xiàn)關(guān)于具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力菌株的N2O控逸研究報(bào)道不多. 本研究從實(shí)驗(yàn)室SBR反應(yīng)器活性污泥中篩選兼具異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的菌株，對(duì)其各種生長(zhǎng)特性和脫氮性能、N2O逸出情況進(jìn)行研究和鑒定，以期為該菌株的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1　材料與方法

1.1　菌株來源

該菌株來源于以硝酸鹽為底物的SBR反應(yīng)器(TN去除率80.0%～85.0%，CODCr去除率85%～90%)中的活性污泥.

1.2　培養(yǎng)基

溴百里酚藍(lán)(BTB)初篩培養(yǎng)基(g/L)[7]：瓊脂20，KNO31，KH2PO41，F(xiàn)eC12·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸鈉8.5，BTB(0.1 BTB溶于10 mL乙醇)1 mL，用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.3，121 ℃滅菌20 min，備用.

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：KNO31,KH2PO41,FeCl2·6H2O 0.05,CaCl2·7H2O 0.02,MgSO4·7H2O 1,琥珀酸鈉8.5，121 ℃滅菌20 min，備用.

DM反硝化培養(yǎng)基(g/L)[8]：KNO30.72，KH2PO41，MgSO4·7H2O 1，琥珀酸鈉2.8，調(diào)節(jié)初始pH值7.0，121 ℃滅菌20 min，備用.

硝化富集培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO40.47，KH2PO41.0，F(xiàn)eCl2·6H2O 0.5，CaCl2·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 1.0，檸檬酸三鈉4.08，121 ℃滅菌20 min，備用.

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO40.47，琥珀酸鈉5.62，50 mL維氏鹽溶液，121 ℃滅菌20 min，備用.

維氏鹽溶液(g/L)：K2HPO45.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，NaCl 2.5，MgSO4·7H2O 2.5，MnSO4·4H2O 0.05，溶解后加水定容至1 L.

1.3　菌株的篩選與脫氮性能測(cè)定

1.3.1菌株的篩選

采用梯度稀釋法將污泥樣品稀釋至適當(dāng)濃度，取0.1 mL均勻涂布于BTB培養(yǎng)基表面，置入恒溫培養(yǎng)箱，30 ℃培養(yǎng)2～3 d后，用接種環(huán)挑取使周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的單菌落，進(jìn)行分離純化即為初篩菌株. 將初篩菌株接種于瓊脂斜面上，在4 ℃冰箱中保存.

1.3.2菌株的好氧反硝化性能測(cè)定

1.3.3菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能和脫氮產(chǎn)物N2O的測(cè)定[9-10]

1.4　菌株的鑒定

1.4.1形態(tài)觀察

觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色，用掃描電鏡觀察[11]菌體形態(tài).

1.4.2生理生化鑒定

依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]進(jìn)行生理生化測(cè)定.

1.4.3Biolog自動(dòng)微生物鑒定

Biolog自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)[13]利用微生物對(duì)95種不同碳源的代謝情況來鑒定菌種，即各種菌形成各自特有的代謝指紋圖譜，選用四唑類物質(zhì)作為菌株能否利用供試碳源的指示劑. 將菌株接種于BUG+B平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，用無(wú)菌棉簽將平板上的菌體洗下，與接種液(GN/GP-IF+T)混合，制成菌懸液，用濁度計(jì)調(diào)整至20%透光率. 用8孔電動(dòng)加液器將菌懸液分別加在Biolog微孔鑒定板的各孔中，每孔150 μL. 將微孔鑒定板放在37 ℃培養(yǎng)箱中，在培養(yǎng)24 h后將其置于Biolog讀數(shù)儀上與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比并讀取結(jié)果.

1.4.4菌株的分子生物學(xué)鑒定[14]

菌株的DNA提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司). 16S rDNA基因擴(kuò)增引物采用通用引物，正向引物為27f (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)，反向引物為1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，由英俊生物科技有限公司合成. PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×PCR Buffer(含15 mmol MgCl)5 μL，dNTPs 4 μL, 引物27f和1492r各2.5 μL，雙重蒸餾水34 μL，混勻后加入DNA模板2.5 μL，Taq酶0.5 μL. PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性，30 s, 52 ℃退火，80 s, 72 ℃延伸，90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析，交由天根生物科技有限公司測(cè)序. 將菌株的16S rDNA序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比較，通過CLUSTALX[15]、MEGA[16]等軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并以Neighbor-Joining[17]法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分支聚類的穩(wěn)定性用Bootstrap方法進(jìn)行評(píng)價(jià).

1.5　分析方法

1.5.1水體中各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定[18]

氨氮測(cè)定采用GB 7479—87納氏試劑分光光度法，硝態(tài)氮測(cè)定采用GB 7480—87酚二磺酸紫外分光光度法，亞硝態(tài)氮測(cè)定采用GB 7493—87 N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法. 菌體量：光密度法，用721型分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定吸光度值. 水中CODCr采用CODCr快速測(cè)定儀(5B-1型，蘭州連華儀器有限公司)測(cè)定.

1.5.2氣體N2O的測(cè)定

該研究采用GC-TCD法測(cè)定N2O氣體, 具體操作方法為: 每隔2 h在發(fā)酵罐排氣口處用100 mL玻璃注射器緩慢勻速抽取氣體, 立即注入用高純氮清洗并抽成真空的500 mL或1 L氣袋中. 測(cè)定時(shí)用10 mL氣體樣品鎖式進(jìn)樣器(美國(guó)HAMILTON公司) 從氣袋中準(zhǔn)確抽取一定量氣體進(jìn)行GC-ECD分析. 氣體N2O的測(cè)定選用的綜合色譜條件為：檢測(cè)器溫度(TD)(350 ℃)、分離柱溫度(TC)(50 ℃)、載氣流速(fC)(20 mL/min). 實(shí)驗(yàn)中主要采用Varian 3800型氣相色譜儀;10mci63Ni型電子捕獲檢測(cè)器(ECD); 3 m×3 mm不銹鋼柱, 填充固體Porapak Q柱, 80/100目.

2　結(jié)果與討論

2.1　菌株的形態(tài)學(xué)特征分析

菌株WYLW-X06在平板上培養(yǎng)24 h后，形成直徑3～5 mm的圓形菌落，菌落表面粗糙、隆起，灰白色. 光學(xué)顯微鏡觀察該菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿菌，有芽孢. 電鏡觀察該菌呈直桿狀，大小(10～13) μm×(3～4) μm，兩端鈍圓、無(wú)鞭毛. 菌株的電鏡照片見圖1.

圖1　菌株WYLW-X06的電鏡照片(20 000×)Fig.1　Electron microscope of WYLW-X06 strain(20 000×)

2.2　菌株的生理生化鑒定結(jié)果

細(xì)菌的新陳代謝類型不同，對(duì)各種生理生化試驗(yàn)的不同反應(yīng)，顯示出各類菌種間酶系統(tǒng)的不同，可作為細(xì)菌分類鑒定的重要依據(jù). 菌株WYLW-X06生理生化鑒定結(jié)果見表1. 根據(jù)形態(tài)學(xué)和生理生化特征測(cè)定結(jié)果，初步鑒定菌株WYLW-X06是芽孢桿菌屬(Bacillus.sp).

表1　菌株WYLW-X06的生理生化特征

2.3　Biolog鑒別分析

經(jīng)Biolog讀數(shù)儀分析代謝指紋，菌株WYLW-X06可利用95種碳源中的44種碳源，對(duì)其他51種碳源不能利用或利用能力較弱. 與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后，給出鑒定結(jié)果：該菌與蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性指數(shù)為0.644. Biolog鑒定結(jié)果如表2.

2.4　菌株WYLW-X06的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.4.1菌株WYLW-X06的16S rDNA的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

用菌株WYLW-X06的基因組DNA作模板，利用16S rDNA通用引物(27 f和1 492 r)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)約1.5 kb的目的片段，擴(kuò)增結(jié)果見圖2. 對(duì)擴(kuò)增得到的16S rDNA片段測(cè)序，測(cè)得菌株WYLW-X06的16S rDNA總共1 440個(gè)堿基，在核酸數(shù)據(jù)GenBank (NCBI)申請(qǐng)的登錄號(hào)為：GU116563.

表2　菌株WYLW-X06 Biolog特征

圖2　菌株WYLW-X06的16S rDNA的PCR電泳圖Fig.2　　　　Electrophoresis map of cloning procedure of 16S rDNA from WYLW-X06

2.4.2菌株WYLW-X06的系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中8株同源性相近的細(xì)菌與WYLW-X06構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖3. 由圖3看出，菌株WYLW-X06與蠟狀芽孢桿菌屬相似性最高，同源性達(dá)99%，所以菌株WYLW-X06是蠟狀芽孢桿菌屬的一種. 16S rDNA鑒定結(jié)果與Biolog鑒定結(jié)果相對(duì)照，可證實(shí)菌株WYLW-X06是蠟狀芽孢桿菌.

圖3　菌株WYLW-X06的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹Fig.3　Consensus phylogenetic tree for strain WYLW-X06

2.5　菌株WYLW-X06的脫氮性能研究

2.5.1菌株WYLW-X06的好氧反硝化性能研究

以KNO3為唯一氮源，琥珀酸鈉為碳源，初始氨氮濃度為78 mg/L，C/N為15，DO為120 r/min，pH值為7.0，溫度30 ℃，連續(xù)培養(yǎng)4 d. 菌株WYLW-X06的培養(yǎng)液中氮素濃度的變化見圖4.

圖4　菌株WYLW-X06的好氧反硝化作用Fig.4　Aerobic denitrification of strain WYLW-X06

由圖4看出，培養(yǎng)液中硝基氮質(zhì)量濃度由初始的78 mg/L降低到2.09 mg/L，去除率達(dá)到97.32%，總氮去除率達(dá)到96.35%. 亞硝基氮濃度一直處于很低水平. 證明菌株WYLW-X06具有良好的反硝化能力，確實(shí)是一株高效的具有好氧反硝化能力的菌株.

2.5.2菌株WYLW-X06的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能和脫氮產(chǎn)物N2O的研究

以(NH4)2SO4為唯一氮源，琥珀酸鈉為碳源，初始氨氮濃度為85 mg/L，COD/N為20，DO為120 r/min，pH值為7.0，溫度30 ℃，培養(yǎng)周期為58 h，取樣時(shí)間間隔為2 h. 菌株WYLW-X06的培養(yǎng)液中氮素和碳源濃度的變化見圖5.

圖5　　　　好氧條件下菌株WYLW-X06對(duì)溶液中氨氮和碳源濃度變化的影響Fig.5　　　　Effect of strain WYLW-X06 on nitrogen and carbon source concentration in the denitrification culture medium under aerobic incubation

由圖5看出，在發(fā)酵罐培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)氨氮去除率達(dá)97.19%，總氮去除率96.63%，脫氮效果良好. 在培養(yǎng)過程中，從4h開始，OD600持續(xù)上升，56 h時(shí)達(dá)到最大值0.838. 同時(shí)僅能檢測(cè)出少量硝基氮和亞硝基氮，說明菌株既進(jìn)行了硝化作用，同時(shí)也進(jìn)行了好氧反硝化作用. 值得關(guān)注的是，在菌株進(jìn)行脫氮的同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)液中碳源的消耗和利用也十分顯著. CODCr從初始的1 565.20 mg/L降到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的165.6 mg/L，減少了1 399.6 mg/L，COD去除率達(dá)89.4%. CODCr的減少一方面是由于部分有機(jī)物被微生物分解而提供能量和被微生物利用合成了新的細(xì)胞物質(zhì)所致，另一方面，大部分CODCr在反硝化階段作為碳源被微生物直接利用了.

3　結(jié)　論

1)采用極限稀釋和BTB培養(yǎng)基篩選的方法，并通過硝化-反硝化性能測(cè)定從味精廢水末端處理系統(tǒng)的活性污泥中篩選出一株高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌WYLW-X06. 通過形態(tài)特征觀察、生理生化特征測(cè)定、Biolog鑒定，以及16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定菌株WYLW-X06是蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus).

2)在好氧條件下，異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌WYLW-X06能夠高效脫氮，且生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng). 在發(fā)酵罐中對(duì)菌株WYLW-X06進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，其氨氮去除率為97.19%，且反應(yīng)過程中僅檢測(cè)出少量的亞硝基氮積累. 該菌株的環(huán)境適應(yīng)能力提高，硝化作用啟動(dòng)迅速，具有完整的脫氮酶系統(tǒng)，可進(jìn)行從氨氮→硝基氮→亞硝基氮→脫氮?dú)怏w產(chǎn)物這一完整的硝化-反硝化過程，同時(shí)該菌株產(chǎn)生的N2O是微量的，可實(shí)現(xiàn)N2O生物控逸的目的. 因此該菌株具有潛在工程應(yīng)用價(jià)值.

3)作為細(xì)菌的鑒定手段，將Biolog系統(tǒng)與16S rDNA序列分析方法結(jié)合可以獲得較可靠的鑒定結(jié)果. 兩者相互驗(yàn)證，相互補(bǔ)充，提高了工作效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性，具有良好的可操作性.