不同劑量維生素 C藥物后處理對腎缺血再灌注損傷的影響

陸佳偉,賈俊海,張 鋒,韓 春

對于缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,早在 1986年 Murry 等[1]就首次提出缺血預(yù)處理這種經(jīng)典的器官保護(hù)方法,但由于預(yù)處理是在缺血前應(yīng)用,而臨床中的缺血往往是未知的,所以預(yù)處理的這種局限性使得其未能在臨床上真正地推廣和應(yīng)用。2003年,Zhao等[2]又提出了缺血后處理 (ischemic postconditioning,IPC)的概念,但缺血后處理是在再灌注前即刻進(jìn)行數(shù)次、短暫的缺血再灌注 (ischemia-reperfusion,I/R),其本質(zhì)具有侵害性,于是近兩年人們又考慮到一種新的缺血保護(hù)策略,即藥物后處理 (pharmacological postconditioning)。藥物后處理是缺血后處理研究的深入,是一種利用藥物干預(yù)的缺血保護(hù)措施[3]。但目前仍有許多問題困擾著我們:是否有種屬的差異、最佳后處理方式 (麻醉藥濃度、持續(xù)時(shí)間)和時(shí)機(jī) (開始干預(yù)和結(jié)束時(shí)間)的選擇、遠(yuǎn)期結(jié)果的評估以及進(jìn)一步明確其作用機(jī)制等。本實(shí)驗(yàn)將主要研究不同劑量維生素 C后處理對腎缺血再灌注損傷的影響及核因子 -κB亞基 p65親和肽 (NF-κBp65)、一氧化氮 (NO)在腎缺血再灌注損傷中的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 體質(zhì)量 240～250 g的健康成年雄性 SD大鼠 30只(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、血尿素氮 (BUN)、肌酐 (Cr)和 NO試劑盒(由南京建成生物工程研究所提供)。兔 NF-κBp65多克隆抗體、DAB顯色試劑盒、即用型 SABC染色試劑盒 (由武漢博士德生物工程有限公司提供)。維生素 C注射液 (無錫市第七制藥有限公司)。UV2754分光光度計(jì) (上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備 (1)實(shí)驗(yàn)分組:將 SD大鼠隨機(jī)分為 5組,每組6只。①假手術(shù)組 (Sham組);②腎臟缺血再灌注處理組 (RIR組);③低劑量維生素 C后處理組 (LVc-PO組);④中劑量維生素 C后處理組 (MVcPO組);⑤高劑量維生素 C后處理組 (HVcPO組)。 (2)模型制備:實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前禁食 12 h,自由進(jìn)水。將大鼠用 30 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,去毛、固定,沿上腹部正中線逐層切開,顯露和游離腎臟,仔細(xì)分離腎蒂,保護(hù)輸尿管。用無損傷動脈夾夾閉腎蒂,腎臟顏色變?yōu)榘导t色可確認(rèn)為腎臟血流阻斷,造成腎缺血,而后松開動脈夾,腎臟由暗紅色轉(zhuǎn)為鮮紅色可確認(rèn)為血流恢復(fù)。Sham組:僅行開腹后游離雙側(cè)腎臟,動脈夾夾閉右側(cè)腎蒂,0.9%氯化鈉溶液紗布覆蓋傷口,暴露 45 min后逐層縫合關(guān)腹,2 h后留取標(biāo)本;RIR組:動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂,45 min后恢復(fù)血供,余同上;LVcPO組:動脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂,45 min后再灌注前于大鼠舌靜脈注射維生素 C 10 mg/kg,松開左側(cè)動脈夾恢復(fù)血供,2 h后留取標(biāo)本;MVcPO組:注射維生素 C劑量為 20 mg/kg,余同 LVcPO組;HVcPO組:注射維生素 C劑量為 40 mg/kg,余同 LVcPO組。

1.2.2 標(biāo)本留取及指標(biāo)檢測 標(biāo)本留取:再灌注 2 h時(shí),打開大鼠胸腔抽取 2～4 ml心臟血后處死動物。將所抽血液置于抗凝管內(nèi),靜置 4 h后以 4 500 r/min離心 15 min,分離血清,-20℃保存待用。分離左側(cè)腎臟周圍結(jié)締組織后,以 4℃的0.9%氯化鈉溶液沖洗表面血液,濾紙吸干表面水分,將腎臟縱剖成 2份,1份制備成 10%的組織勻漿,另 1份用 4%多聚甲醛固定后石蠟切片檢測 NF-κBp65在腎組織的表達(dá)。指標(biāo)檢測:(1)腎功能:采用化學(xué)比色法檢測血 BUN及 Cr。(2)腎組織氧化損傷和抗氧化指標(biāo):SOD檢測采用黃嘌呤氧化酶法;MDA檢測采用硫代巴比妥酸 (TBA)法;NO檢測采用硝酸還原酶比色法。 (3)免疫組化測定 NF-κBp65蛋白表達(dá):將標(biāo)本切片脫蠟至水化、小牛血清封閉、滴加一抗、孵育、加二抗、加 SABC工作液、DAB顯色,復(fù)染、透明、封固,光鏡下觀察,細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒沉積為 NF-κBp65表達(dá)陽性,以已知陽性片作為陽性對照,用 PBS代替一抗作為陰性對照。染色標(biāo)記強(qiáng)度用光密度值 (OD)表示。以上所有檢測步驟嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用 SPSS 11.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以 (x±s)表示,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較應(yīng)用 q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清 BUN和 Cr水平變化 與 Sham組比較,RIR組血BUN和 Cr水平升高 (P＜0.01);與 RIR組比較,LVcPO組、MVcPO組、HVcPO組的 BUN和Cr水平降低 (P＜0.05,見表1)。

2.2 腎組織 SOD、MDA、NO的變化 與 Sham組比較,RIR組 SOD活性下降 (P＜0.01),MDA、NO水平升高 (P＜0.01)。與 RIR組比較,LVcPO組、MVcPO組、HVcPO組的SOD活性上升 (P＜0.05);MDA、NO水平下降 (P＜0.05,見表 2)。

表 1 各組大鼠血BUN和 Cr水平比較 (x±s)Table 1 Comparison of level of serum BUN and Cr in five groups

表 2 5組大鼠腎組織 SOD活性及 MDA和 NO水平比較 (x±s)Table 2 Comparison of level of SOD、 MDA、 NO in renal tissue in rats of five groups

2.3 腎組織 NF-κBp65表達(dá) 高倍鏡下觀察,Sham組腎組織 NF-κBp65有極少量的陽性表達(dá);RIR組 NF-κBp65在腎小管上皮細(xì)胞陽性表達(dá)明顯,有大量棕黃色顆粒,呈彌漫性分布,在腎小球未觀察到明顯棕黃色顆粒;LVcPO組、MVcPO組、HVcPO組陽性細(xì)胞較 Sham組增多,但較 RIR組明顯減少,其中以 HVcPO組陽性細(xì)胞最少 (見圖 1、圖 2)。

圖 1 光鏡下腎組織NF-κBp65的陽性分布Figur e 1 Morphological observation of description of positive NF-κBp 65 in renal tissue

圖 2 腎組織 NF-κBp65表達(dá)的變化Figure 2 The change of the expression of NF-κBp65 in renal tissue

3 討論

在器官發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí),有多種因素參與了這一過程,其機(jī)制可能與氧自由基產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)和激酶的激活有關(guān)[4-5]。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于各種真核細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)、外的多種因素如氧自由基、炎癥因子等均可調(diào)控 NF-κB的活化,而活化的NF-κB又調(diào)控著多種與生理、病理相關(guān)的基因表達(dá),通過多種途徑介導(dǎo)機(jī)體的炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖與凋亡及自由基損傷等一系列病理反應(yīng)。近年的研究顯示,NF-κB的活化參與了缺血再灌注損傷[6]。靜息狀態(tài)下 NF-κB多以 p50和 p65二聚體與其抑制蛋白 IκB相結(jié)合而存在于胞質(zhì)中,呈無活性狀態(tài)。當(dāng)受到腎缺血再灌注損傷產(chǎn)生的大量過氧化物和氧自由基等外源性刺激時(shí),IκB迅速磷酸化而與NF-κB解離,活化的 NF-κB進(jìn)入到細(xì)胞核激活介導(dǎo)炎癥因子、細(xì)胞因子、黏附分子等多種基因的表達(dá),直接或間接參與缺血再灌注損傷[7]。

NO作為一種新型生物信使分子,具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性,由一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase,NOS)催化 L-精氨酸而產(chǎn)生。目前已知 NOS具有兩類同工酶,即結(jié)構(gòu)型 (cNOS)和誘生型 (iNOS)[8]。在正常生理情況下,由 cNOS介導(dǎo)產(chǎn)生少量的 NO,對腎臟具有直接保護(hù)作用,調(diào)節(jié)血管緊張性,抑制血小板聚集,清除氧自由基等。當(dāng)腎 I/R損傷導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí),cNOS誘導(dǎo)的 NO釋放減少,同時(shí)再灌注時(shí),產(chǎn)生的大量氧自由基對組織造成損傷并激活NF-κB,促進(jìn)炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生,可刺激 iNOS異常表達(dá),催化產(chǎn)生大量的 NO,高濃度的 NO可與 O-2反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽 (ONOO-),在酸性條件下又可分解成毒性更強(qiáng)的自由基如 NO-2和 OH-等,最終導(dǎo)致腎臟的病理性損傷。

氧自由基引發(fā)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化生成 MDA,其生成和脂質(zhì)過氧化相平行,因此 MDA含量的高低可反映腎組織細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD作為一個(gè)重要的抗氧化酶,可以歧化 O2-生成 H2O2。SOD作用的重要意義在于清除 H2O2和 OH-的前身 O2-,從而保護(hù)細(xì)胞不受毒性氧自由基的損傷。SOD活性的大小可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Sham組腎組織及腎功能均無明顯的病理變化,NF-κBp65的陽性表達(dá)也很少;而 RIR組腎小管內(nèi)皮細(xì)胞水腫變性壞死,腎功能嚴(yán)重受損,腎組織 NF-κBp65的表達(dá)明顯增強(qiáng),NO水平明顯升高。根據(jù)已有研究表明缺血后處理、藥物預(yù)處理對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與氧自由基產(chǎn)生減少有關(guān),在肝臟、腦、腸黏膜缺血再灌注損傷的研究中也有同樣的趨勢[9-10]。因此本實(shí)驗(yàn)采用維生素 C這一水溶性抗氧化劑來進(jìn)行腎缺血再灌注損傷不同劑量藥物后處理的研究。維生素 C能通過提供電子給·OH或 O2-,使之失活,變成低活性脫氧抗壞血酸,因而具有廣泛的抗氧化損傷能力,且在組織受到氧化損傷時(shí)作為第一道防線最先被消耗[11]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)低劑量維生素 C后處理,血 BUN和 Cr水平,腎組織 MDA水平較 RIR組降低,SOD活性有所上升,同時(shí)腎小管內(nèi)皮細(xì)胞水腫及壞死程度也較 RIR組減輕,提示可能此時(shí)腎組織內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷程度減輕,機(jī)體清除自由基的能力增強(qiáng),以致 NF-κBp65的表達(dá)減弱,炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生相應(yīng)減少,其催化產(chǎn)生的 NO量也開始下降,最終使腎組織的損傷減輕。經(jīng)中劑量維生素 C后處理,發(fā)現(xiàn)腎小管損傷程度顯著改善,腎功能指標(biāo)血 BUN、Cr水平,腎組織 MDA和 NO水平、NF-κBp65的表達(dá)較 RIR組明顯下降,腎組織 SOD的活性較 RIR組明顯升高。由此進(jìn)一步證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞 NF-κB的表達(dá)及腎組織 NO水平的變化與腎缺血再灌注損傷有著密切關(guān)系。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)高劑量維生素 C后處理,腎小管損傷程度以及腎功能有更為明顯的改善,血 BUN、Cr水平,腎組織 MDA和 NO水平、SOD活性、NF-κBp65的表達(dá)均與 MVcPO組相一致且表現(xiàn)得更加明顯。此實(shí)驗(yàn)表明維生素 C后處理同樣也有著明顯的對腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,抑制 NF-κB的表達(dá),降低腎組織NO水平可能是其作用機(jī)制之一。通過低、中、高 3種不同劑量維生素 C后處理,發(fā)現(xiàn)隨著藥物劑量的增高對腎缺血再灌注的保護(hù)效果增強(qiáng),呈明顯的劑量依賴性,即后處理藥物的劑量越高對腎缺血再灌注的保護(hù)效果越好,但這僅限于在本實(shí)驗(yàn)研究的劑量范圍內(nèi),在此以外是否具有劑量 -效應(yīng)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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