遺傳背景對 2型糖尿病患者膳食干預(yù)效果影響的研究

孔令斌,房玉海,丁守華,楊志寅,卜志強(qiáng),劉 東,陳 鵬

2型糖尿病 (T2DM)是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的一類代謝異常綜合征。WHO報(bào)告顯示,1998年 DM居全球疾病死因順位的第六位,疾病負(fù)擔(dān)順位第三位,近年來其發(fā)病率急劇升高,而且其發(fā)病年齡日趨年輕化,已成為世界各國日益關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。因此研究 T2DM發(fā)生的危險(xiǎn)因素,對于實(shí)施有針對性的預(yù)防干預(yù)措施,延緩或防止 T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展具有重要的臨床意義[2-5]。T2DM的病因復(fù)雜,并非由單一因素所致,遺傳、環(huán)境因素及不良生活方式和行為習(xí)慣在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均起著非常重要的作用[6]。由于飲食模式影響機(jī)體的血糖、血脂的代謝,因此,采用各種有效的干預(yù)措施來降低血糖和血脂水平是目前許多國家 DM及心腦血管疾病防治工作的重點(diǎn)[7-8]。目前已有大量研究證實(shí)了以膳食干預(yù)為主的綜合干預(yù)措施的有效性,然而,在臨床上并不是每一位 T2DM患者經(jīng)過膳食行為干預(yù)后都能夠取得滿意的效果,考慮可能與患者的遺傳背景有關(guān)[9]。因此,有必要探討基因多態(tài)性對 T2DM的發(fā)病及其治療干預(yù)措施的影響,為制定更為個體化的膳食干預(yù)對策提供科學(xué)依據(jù),減少治療的盲目性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于 2003年 9月—2005年 9月在山東省梁山縣疾病預(yù)防控制中心糖尿病門診隨機(jī)抽取 378例自愿參加研究的新發(fā) T2DM患者為研究對象,均符合 WHO 1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。檢測其脂蛋白脂酶 (LPL)基因 S447多態(tài)性,根據(jù)基因型分為兩組,一組為 LPL S/X+X/X基因型 (A組),另一組為 S/S基因型 (B組)。然后對兩組患者只進(jìn)行飲食干預(yù),干預(yù)時間為 2年,隨訪結(jié)束后,共隨訪到依從性強(qiáng)的T2DM患者 342例,隨訪率為 90.48%,其中 A組 60例,B組282例,檢測兩組患者的空腹血糖 (FPG)、血脂等指標(biāo)并進(jìn)行比較。干預(yù)前兩組患者的性別、年齡、血糖、血脂等指標(biāo)間差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05,見表 1、2),具有可比性。

1.2 方法 取患者空腹肘靜脈血5 ml,將其中 3 ml血液當(dāng)日分離血清,采用全自動血液生化分析儀檢測血糖、血脂;另外2 ml用 5%的 EDTA-Na2(1 ml血液加 20μl抗凝劑 ),用于基因組 DNA提取。(1)基因組 DNA抽提:低滲溶血法制備白細(xì)胞,苯酚氯仿抽提 DNA。(2)PCR擴(kuò)增:以提取的 DNA為模板,利用設(shè)計(jì)的上、下游引物特異性擴(kuò)增 LPL基因 S447位點(diǎn)的特異片段。引物序列為:上游引物 5′-TACACTAGCAATGTCTAGGTGA-3′;下 游 引 物 5′-TCAGCTTTAGCCCAGAATGC-3′。PCR反應(yīng)總體積為 40μl,其中含 10×PCR Buffer 4μl,10 mmol dNTPs 0.8μl,上下游引物各8 pmol,Taq酶 3 U,膜板 3μl,加無菌去離子水至 40μl。取單份 PCR反應(yīng)管,加入提取的基因組 DNA(或陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品)3μl,10 000 r/min瞬時離心 30 s。將各反應(yīng)管做好標(biāo)記,置入 PCR反應(yīng)槽,按照下列條件擴(kuò)增,循環(huán)條件:94℃變性 2 min,93℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共 35個循環(huán),最后 72℃延伸 5 min。 (3)電泳檢測:取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 10μl,加 2 μl 6×Loading Buffer,加樣點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中,以 5 V/cm電壓,1×TAE中電泳,紫外燈下觀察結(jié)果,凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用 (x±s)表示,采用 t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料的比較采用 χ2檢驗(yàn),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 1 干預(yù)前兩組患者的性別和年齡比較 (例)Table 1 The comparison of enumeration indexes between A group and B group before dietary intervention

2 結(jié)果

2.1 S/X及 X/X基因型患者膳食行為干預(yù)前后各項(xiàng)觀察指標(biāo)的比較 LPLS/X及 X/X基因型患者在膳食行為干預(yù)后 FPG、腰臀圍比值 (WHR)及三酰甘油 (TG)水平降低,而體質(zhì)指數(shù) (BMI)、血清高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)水平升高,干預(yù)前后比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);血總膽固醇(TC)水平及收縮壓 (SBP)在干預(yù)前后差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05,見表 3)。

2.2 S/S基因型患者膳食行為干預(yù)前后各項(xiàng)觀察指標(biāo)的比較LPL S/S基因型患者在膳食行為干預(yù)前后血脂水平及 BMI、WHR、SBP比較差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05),盡管干預(yù)前后 FPG水平差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01),但 S/S基因型患者干預(yù)后 FPG平均水平仍處在非正常范圍內(nèi) (見表 4)。

2.3 膳食行為干預(yù)后不同基因型患者各項(xiàng)指標(biāo)的比較 干預(yù)后 A組患者的 FPG、TG、BMI及 WHR低于 B組患者,HDLC水平高于 B組患者,差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05,見表5)。

表 2 干預(yù)前兩組患者的血糖和血脂等指標(biāo)比較 (x±s)Table 2 The comparison of measurement indexes between A group and B group before dietary intervention

表 3 S/X及 X/X基因型患者膳食行為干預(yù)前后血糖和血脂等指標(biāo)的比較 (x±s)Table 3 The comparison of indexes in patients with S/X and X/X genotype before and after intervention

表 4 S/S基因型患者膳食行為干預(yù)前后血糖和血脂等指標(biāo)的比較 (x±s)Table 4 The comparison of indexes in patients with S/Sgenotype before and after intervention

表 5 膳食行為干預(yù)后兩組患者的血糖和血脂等指標(biāo)比較 (x±s)Table 5 The comparison of indexes between patientswith differert genotypes after intervention

3 討論

LPL是水解脂蛋白中 TG的重要酶類,主要由脂肪細(xì)胞、心肌、骨骼肌等肝外實(shí)質(zhì)細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并分泌,釋放入血后,借助硫酸肝素等葡糖胺聚糖結(jié)合在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)揮其生理功能?；钚孕问綖橥ㄟ^非共價鍵結(jié)合形成的同源二聚體,二聚體分離則脂解 TG的活性進(jìn)行性喪失,其催化中心由 Ser132、Asp156、His241組成[11]。載脂蛋白 CⅡ (apoCⅡ)為 LPL的激活劑,載脂蛋白 CⅢ (apoCⅢ)則抑制其活性。LPL主要生理功能是水解血液中富含 TG脂蛋白中的三脂酰甘油,使其分解為甘油二酯和甘油一酯,釋放游離脂肪酸以供組織氧化分解并為機(jī)體提供能量,是清除血液中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白 (VLDL)的限速酶。

LPL基因存在著多種變異方式,目前發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)有Asp9Asn、Asn291Ser、Ser447Ter、PvuⅡ、HindⅢ、 BamHI、BstⅠ、BglⅡ、XbaⅠ等,LPL基因突變可導(dǎo)致其活性的變化,進(jìn)而影響到其脂解功能。在以上基因位點(diǎn)突變中,目前大多數(shù)研究認(rèn)為,PvuⅡ、HindⅢ多態(tài)性變化能夠降低脂蛋白脂酶的活性,引起脂質(zhì)代謝紊亂,而對于 LPL基因 S447X多態(tài)性則多數(shù)研究認(rèn)為該基因突變是一種保護(hù)性變異,能夠改善血脂譜。Nierman等[12]研究顯示,LPLS447X攜帶者血液中含豐富三酰甘油的脂蛋白 (TRL)轉(zhuǎn)化增快,LDL apoB100清除率增加,并且肝前血漿 LPL濃度增長了 4倍。關(guān)于該多態(tài)性對 TG和 HDL-C的影響,Lee等[13]通過對居住新加坡的華人、馬來人及亞洲印第安人的研究顯示,LPLS447X多態(tài)性在該研究人群中發(fā)生率很高,且 X447等位基因攜帶者血 TG水平較非基因突變者明顯降低,而血漿 HDL-C水平則明顯升高。同時該研究還發(fā)現(xiàn),在女性 X447攜帶者中,血漿 LDL-C水平也明顯下降。Thu等[14]對 351位越南 7～9歲女孩研究發(fā)現(xiàn),與S447S基因型相比較,S447X多態(tài)性與血漿高 HDL-C水平相關(guān) (7.4%,P=0.007),并且會導(dǎo)致血 TG水平降低(-13.6%,P=0.04)。Wittrup等[15]對丹麥正常人及心肌缺血者的研究顯示,女性 S447X攜帶者雜合型和純合型血漿 TG水平分別下降 0.11 mmol/L和 0.18 mmol/L(P=0.001和 P=0.37);HDL-C水平分別升高 0.07 mmol/L和 0.03 mmol/L(P=0.001和 P=0.99)。男性雜合型和純合型攜帶者血漿 TG水平分別下降 0.20 mmol/L和 0.41 mmol/L(P＜0.001和 P=0.06);HDL-C水平分別升高 0.05 mmol/L和 0.17 mmol/L(P=0.02和 P=0.04)。但亦有對亞洲種族的研究認(rèn)為 X447等位基因與 HDL-C水平之間關(guān)聯(lián)不明顯[16],甚至沒有關(guān)聯(lián)[17]。

本研究結(jié)果顯示,LPL S/X及 X/X基因型患者在膳食行為干預(yù)后 FPG、TG等指標(biāo)水平明顯降低而血漿 HDL-C水平明顯升高,干預(yù)前后有明顯差別;S/S基因型患者在膳食行為干預(yù)后盡管血脂水平較干預(yù)前有所降低,但差別無顯著性。對不同基因型患者膳食干預(yù)后各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),S/X及X/X基因型患者干預(yù)后 FPG、TG及 HDL-C等指標(biāo)變化幅度顯著大于 S/S基因型患者,表明 S/X及 X/X基因型的 T2DM患者對膳食干預(yù)更為敏感。進(jìn)一步表明 LPLS447X基因型不僅影響正常人的血脂水平,而且影響 T2DM患者的血脂、血糖水平。提示臨床醫(yī)生在制定和實(shí)施膳食干預(yù)措施時,除考慮患者的年齡、性別、吸煙、飲酒等生活習(xí)慣外,還必須考慮患者自身的遺傳背景,有針對性地開展飲食干預(yù),以減少干預(yù)治療的盲目性,提高 T2DM的治療效果,減少不必要的人力、物力和財(cái)力資源的浪費(fèi)。

LPLS447X多態(tài)性有益于患者血脂、血糖水平。雖然有研究認(rèn)為其機(jī)制可能通過改變 LPL結(jié)構(gòu)產(chǎn)生缺陷的 LPL分子;也可能通過增加或降低 mRNA轉(zhuǎn)錄,最終影響蛋白質(zhì)水平;或通過其他潛在機(jī)制影響 LPL酶活性及 LPL的其他功能,包括催化功能、分泌功能、亞基間的聚合狀態(tài)、與肝素及底物的結(jié)合能力等。對此,部分學(xué)者做出了如下推斷,Nierman等[12]認(rèn)為,可能與截?cái)嗤蛔儗?dǎo)致的 LPL二聚體脂解活性增高有關(guān),或是由于 LPLS447X蛋白質(zhì)在羧基末端缺少了兩個氨基酸致使LPL-TRL結(jié)合更加牢固,調(diào)節(jié)并易化了酶對血脂的轉(zhuǎn)化。也有研究認(rèn)為 S447X突變可能增加了 LPL與脂蛋白及細(xì)胞表面受體的相互作用,或者增強(qiáng)了其酶活性以外的功能,如通過介導(dǎo)受體對脂蛋白攝取的橋梁作用增強(qiáng)從而加快了 TG的清除[18]。亦有研究認(rèn)為突變通過增加或降低 mRNA轉(zhuǎn)錄,最終影響蛋白質(zhì)水平。因此,S447X多態(tài)性究竟是通過哪一種途徑使 LPL生物學(xué)功能發(fā)生改變尚需進(jìn)一步研究。

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