環(huán)境例行定性分析或快速篩選結(jié)果的可靠性

冷 庚，謝 晴，王 彬，楊嘉偉，但德忠

（四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610065）

1 引 言

為了迅速獲取環(huán)境中的可靠信息，例行分析中定性或快速篩選分析越來越廣泛地被采用。這類方法能為突發(fā)性環(huán)境事故的快速處置、決策提供依據(jù)。在應(yīng)急監(jiān)測中，相對于獲得準(zhǔn)確的結(jié)果而言，人們對樣品濃度是否超出相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限量更為重視。此外，定性或快速篩選分析還具有其他一些明顯優(yōu)勢，如成本低廉、分析速度快、操作簡單以及可將采樣和分析過程中因時間耽擱產(chǎn)生的誤差減至最小等。

對未知樣品的測定，應(yīng)首先進行定性與快速篩選分析。為了判斷方法是否符合要求，首先必須了解分析方法的相關(guān)特征，如精密度、適應(yīng)性、可靠性以及檢出限等。對定量分析結(jié)果的可靠度，人們已進行了較廣泛深入的研究。但是，對定性分析或快速篩選分析結(jié)果的可靠度卻少有研究[1-4]。定性分析或快速篩選分析結(jié)果的可靠度不能用與定量分析一樣的方式表達，即不能用表示分析結(jié)果離散度的一個參數(shù)來表示。相反，結(jié)果的可靠性本質(zhì)上具有概率的性質(zhì)，可以用犯錯誤的概率來表示。這些錯誤是隨機的或是由誤差造成的，是分析結(jié)果不可靠的來源。在分析過程中，必須充分考慮不可靠度以及做出誤判的概率。

目前，有人研究了如何處理定性分析或快速篩選分析中結(jié)果的可靠性，但在應(yīng)用方面尚未找到最好的方法[3]。該文介紹用于處理定性分析或快速篩選分析可靠度的一些方法，這些方法均基于概率計算。

2 定性分析中可靠度評估方法

目前，評估不可靠性的方法較多，如貝葉斯定理（Bayes’Theorem）[5]、列聯(lián)表（Contingency Tables）[6]法、類似于定量分析中計算不確定度的統(tǒng)計間隔法以及性能曲線法。

2.1 列聯(lián)表

列聯(lián)表將定性分析視為分類問題。最簡單的情況是將樣品分析結(jié)果分為兩種情況。例如，有毒化合物的濃度或是高于或是低于某一特定值。樣品分析的結(jié)果可能為正（大于或等于某一特定值），也可能為負(fù)（小于某一特定值）。

針對快速篩選分析有兩種結(jié)果并可能反映兩種實際情況，可以建立2×2列聯(lián)表。表的維度可從2×2到n×p，n和p表示類別的數(shù)量。例如，檢測花生中是否含有黃曲霉素，標(biāo)準(zhǔn)允許的最大限量為2μg/g。篩選試驗采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒[7]。當(dāng)黃曲霉素含量高于限量時，發(fā)生免疫反應(yīng)，根據(jù)顏色變化判斷結(jié)果。如果顏色變?yōu)榘咨栃裕?，表明黃曲霉素的含量大于或等于2 μg/g；如果顏色變?yōu)樗{色（陰性），則黃曲霉素的含量小于2μg/g。試驗300個樣品，通過高效液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)其中150個樣品的含量大于或等于2μg/g。其余150個樣品含量均低于限量值。測定結(jié)果的分布如表1所示。

表1 花生中黃曲霉素快速篩選分析的2×2列聯(lián)表

從表1可知，樣品中黃曲霉素的實際含量有“大于或等于”或“小于”兩種情況，對應(yīng)結(jié)果或為陽性（+），或為陰性（-），N為樣本大小。黃曲霉素的分析結(jié)果有4種可能的情況：大于或等于2μg/g，分析結(jié)果為陽性，稱為真陽性，tp=135；類似地，有真陰性，tn=129；假陰性，fn=15；假陽性，fp=21。利用列聯(lián)表還可以評價分析方法的性能，如靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值（PPV）及陰性預(yù)測值（NPV）。

表2 性能參數(shù)的計算表達式

表2中的式（1）可用于計算方法的靈敏度，該靈敏度用試驗獲得的真陽性結(jié)果數(shù)占實際陽性結(jié)果總數(shù)的比來表示。上例中，方法的靈敏度=（135/150）×100=90%，即分析黃曲霉素含量大于或等于2μg/g的100個試樣時，其中90個試樣的結(jié)果呈陽性，10個試樣的結(jié)果呈陰性（假陰性）。然而，理想的分析方法測出的100個試樣中黃曲霉素含量均應(yīng)大于或等于2μg/g。檢測靈敏度也稱為方法的功效。在統(tǒng)計假設(shè)檢驗中，功效定義為1-β，β表示獲得假陰性結(jié)果的概率[6]。

特異性定義為真陰性數(shù)占實際陰性總數(shù)的比例，即表2中的式（2）。上例中，方法的特異性=（129/150）×100=86%，即分析黃曲霉素含量低于2μg/g的100個試樣時，其中86個試樣的結(jié)果呈陰性，14個試樣的結(jié)果呈陽性（假陽性）。而理想的分析方法測出的100個試樣中黃曲霉素含量均應(yīng)低于2 μg/g。在統(tǒng)計假設(shè)檢驗中，特異性與顯著性水平α有關(guān)，α表示獲得假陽性結(jié)果的概率。

根據(jù)不同的分析目的，比特異性更高的靈敏度可能更可取，反之亦然。值得注意的是，靈敏度的增加往往伴隨著特異性的下降，而靈敏度和特異性均取決于樣本大小N。即N越大，列聯(lián)表中包含的信息越多，由此計算出的靈敏度和特異性的可靠性就越高。

陽性預(yù)測值表示試樣結(jié)果呈陽性時，黃曲霉素的實際濃度大于或等于2μg/g的概率。PPV=（135/156）×100=86.5%，表明當(dāng)有100個試樣的結(jié)果呈陽性時，其中86個試樣的含量將大于或等于2μg/g，而有14個試樣的結(jié)果呈假陽性。類似地，陰性預(yù)測值表示真陰性結(jié)果占測出的陰性結(jié)果總數(shù)的比例。上例中，PNV=（129/144）×100=90%，意味著當(dāng)有 100 個試樣的結(jié)果呈陰性時，其中90個試樣的含量將小于2μg/g，而有10個試樣的結(jié)果呈假陰性。

列聯(lián)表常用來估計快速篩選分析的可靠性，以及不同分析方法的比較。這種比較是基于不同篩選方法對相同樣本的靈敏度和特異性而言。值得注意的是，不同方法靈敏度和特異性的差異可能是由偶然性造成的，因為實際情況與檢測結(jié)果間的差異受隨機誤差的影響，當(dāng)試樣數(shù)量較小時更是如此。為了評估這些可能的差別，某些統(tǒng)計檢驗?zāi)軓牧新?lián)表中獲得一些正確的結(jié)論[6]。

列聯(lián)表用于生物檢測（如免疫學(xué)檢測）時，一些術(shù)語和定義與其在分析化學(xué)領(lǐng)域中的含義有所不同，如靈敏度和特異性。盡管列聯(lián)表為試驗方法的整體性能提供了概貌，但是它不能估算個別樣本出現(xiàn)誤差的概率，而且其性能很大程度上取決于樣本的大小以及用于構(gòu)建該表的試驗設(shè)計。

2.2 貝葉斯法

在處理二分結(jié)構(gòu)（如是/否、存在/不存在、成功/失敗）時，貝葉斯法是一種用于表達和更新概率的老方法，在定性分析中已獲得應(yīng)用[5]。當(dāng)考慮到歷史和條件概率分布時，貝葉斯定理可對相似情況下采用類似測量的概率進行預(yù)測[8]。Ellison等[5]評述了貝葉斯定理在計算定性分析結(jié)果可靠性的應(yīng)用，并認(rèn)為貝葉斯定理在測量結(jié)果可靠度方面比列聯(lián)表中的概率更適用。

仍以黃曲霉素為例，在檢測結(jié)果呈陽性（p）的條件下，試樣中黃曲霉素含量大于或等于規(guī)定限量值（a）的條件概率計算表達式為：

式中：a——黃曲霉素含量大于或等于2μg/g；

b——黃曲霉素含量小于2μg/g。

P（a）和 P（b）是各自的事前概率，表示預(yù)先不知道的情況下取得陽性結(jié)果p或陰性結(jié)果n的概率。先驗概率往往是最難量化的參數(shù)。根據(jù)歷史數(shù)據(jù)或經(jīng)驗可以對先驗概率進行估計。當(dāng)無法獲得充足的試驗數(shù)據(jù)，也無法證明黃曲霉素含量是高于還是低于規(guī)定限量值時，先驗概率通常設(shè)為0.5。

P（p/a）表示黃曲霉素含量大于 2 μg/g時，檢測結(jié)果呈陽性的概率，P（p/b）表示黃曲霉素含量低于2 μg/g時，檢測結(jié)果呈陽性的概率。這兩種概率分別與假陰性和假陽性的比例有關(guān)[9]。

準(zhǔn)確地說，假陰性的概率應(yīng)該是P（n/a），它與P（p/a）有關(guān)，即 P（p/a）=1－P（n/a），而 P（p/b）自身就是假陽性概率。Ellison等[5]認(rèn)為，這些概率可通過諸如直接實驗測定、根據(jù)已知或假定的閾值分布以及利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫或理論預(yù)測的方法來評價。第一種方法最簡單，它包括向待分析任務(wù)提交盡可能多的特征材料，然后觀察結(jié)果。對大小為N的樣本，已知黃曲霉素含量均低于2μg/g，當(dāng)檢測結(jié)果有p個陽性時，則P（p/b）=p/N。類似地，已知黃曲霉素含量均大于 2 μg/g，當(dāng)檢測結(jié)果有 n 個陰性時，則 P（n/a）=n/N。同理，當(dāng)試樣中黃曲霉素含量均高于2μg/g時，結(jié)果呈陰性的條件概率可用與式（5）類似的式子計算，不同的只是把公式中的P換成為n。

當(dāng)對先驗概率一無所知時，P（a）和 P（b）都取0.5。如果測試結(jié)果與表1相同，利用貝葉斯定理計算的概率如下：

這意味著，當(dāng)試樣的檢測結(jié)果呈陽性時，黃曲霉素含量高于2μg/g的概率為86.5%。用同樣的方法，可計算出 P（a/n）=0.104。

從上述表達式，可以發(fā)現(xiàn)列聯(lián)表和貝葉斯定理之間存在一定的關(guān)系，因為它們都是基于概率論。這種關(guān)系可通過似然比來建立，似然比是兩個條件概率的比值，并且與列聯(lián)表中靈敏度和特異性這兩個參數(shù)有關(guān)，通過下式可以計算似然比：

應(yīng)當(dāng)指出，如果想用這種方法得到很好的估計值，則需要有大量的分析試樣。從分析的角度來看，貝葉斯法的弊端在系統(tǒng)命名的復(fù)雜化以及難以量化不同概率項。與列聯(lián)表相比，貝葉斯法不僅能對新試樣的可靠性予以估計，還能通過先驗概率將先前的信息統(tǒng)合到一起。

2.3 統(tǒng)計間隔

目前，Pulido等開發(fā)了一種用于計算定性分析結(jié)果可靠度的簡單程序[10]，該程序與計算定量分析的不確定相似，都基于統(tǒng)計間隔，服從高斯正態(tài)分布，并已廣泛用于計算檢出限[11-12]。該程序能建立濃度的標(biāo)準(zhǔn)限量值和儀器響應(yīng)信號間的聯(lián)系，通過比較常規(guī)樣品與標(biāo)準(zhǔn)限量值的響應(yīng)，便可做出“是/否”的決定，其出錯的概率是確定的。該法與前述方法的區(qū)別主要有兩點：由于處理儀器響應(yīng)信號，因此需要連續(xù)數(shù)據(jù)而非二進制數(shù)據(jù)；通過實驗確定分析結(jié)果的可靠性，需制備標(biāo)準(zhǔn)限量濃度的分析樣，而在前述方法中，需制備不同濃度的分析樣。

當(dāng)采用統(tǒng)計間隔時，以中等精度對一套獨立制備的含有標(biāo)準(zhǔn)限量濃度待測物的試樣分析nSL次，以求囊括造成結(jié)果不可靠的主要來源。這樣，可以計算儀器響應(yīng)的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差s。

為了比較某試樣的儀器響應(yīng)ri是否低于、等于或高于標(biāo)準(zhǔn)限量，需要確定閾值rcut-off。假設(shè)儀器響應(yīng)服從正態(tài)分布，則通過平均值單側(cè)的較高或較低預(yù)測界限計算rcut-off：

式中：t（α，υ）——顯著性水平為 α、自由度為 υ 時單側(cè)T統(tǒng)計值；

nSL——計算進行獨立分析的次數(shù)；

m——試樣重復(fù)分析的次數(shù)（通常m=1）；

s——校正樣品儀器響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

SSL和υ的值取決于建立的試驗設(shè)計。在無試驗設(shè)計的情況下，SSL可用式（8）來表示。式（7）中的“±”取決于標(biāo)準(zhǔn)限量以何種方式表述。

仍以黃曲霉素為例，歐盟（EU）相關(guān)法規(guī)規(guī)定其最大含量為2 μg/L。采用熒光快速掃描技術(shù)，分析含2 μg/L黃曲霉素B1的34個樣品，結(jié)果如下：。當(dāng) α=5%時，根據(jù)式（7）和式（8）得。因此的任何樣品在統(tǒng)計學(xué)上若等于或低于則滿足法規(guī)規(guī)定。同理，的任何樣品在統(tǒng)計學(xué)上若高于rSL，則認(rèn)為不符合法規(guī)規(guī)定，該判斷出錯的概率為5%。

由式（7）可知，適應(yīng)性取決于犯I型錯誤或假陽性的先驗概率α。一旦分析人員取定一個α，那么閾值rcut-off可以幫助分析人員對某樣品的適應(yīng)性進行后驗決策。即只有相應(yīng)于測試樣品的儀器響應(yīng)ri被記錄時，才能做出決定，通過這種方式，測量的可靠度就從分析結(jié)果轉(zhuǎn)移到閾值，通過對ri和rcut-off的簡單數(shù)字對比，便能做出適應(yīng)/非適應(yīng)的判斷。這種方法適合日常的快速篩選分析。

篩選限r(nóng)screening也是在考慮到犯II型錯誤或假陰性的β概率下計算出來的[10，13]。仍以黃曲霉素為例，當(dāng)試樣中黃曲霉素濃度未超出標(biāo)準(zhǔn)限量CSL時，β是指試樣符合限量要求，而實際卻高于CSL的概率。為了用式（9）計算rscreening，分析人員必須固定3個參數(shù)α、β或rcreening-中的兩個，后者是ri和間差異的最小預(yù)期值，分析人員希望用試驗結(jié)果得到的α和β的概率對其進行計算（如圖1所示）。

圖1 定性分析中考慮了犯I型和II型錯誤的概率α和β時的標(biāo)準(zhǔn)信號、閾值信號以及篩選限

式中：Δ（α，β，υ）——自由度為nSL-1的非中心t分布的非中心參數(shù)，它取決于出錯概率α和β。

根據(jù)式（9），可推斷出篩選系統(tǒng)中的篩選限取決于犯I型和II型錯誤的概率、篩選方法的精度及實驗結(jié)果，而實驗結(jié)果又取決于標(biāo)準(zhǔn)和試樣的重復(fù)測定次數(shù)。當(dāng)試樣的濃度低于標(biāo)準(zhǔn)限量時，也可通過相同的推理計算篩選限r(nóng)screening，只需將式（9）中的加號變?yōu)闇p號。

篩選限是篩選系統(tǒng)的先驗值，一旦將其賦予濃度意義，它便可以用于不同方法的比較或解決某一具體問題方法的選擇。當(dāng)CSL=0時，篩選限就是檢出限。

這種方法只適于處理能提供數(shù)值和連續(xù)響應(yīng)的儀器篩選系統(tǒng)。通常，用于定量分析的儀器法適合作為篩選法。然而，當(dāng)不能得到二分響應(yīng)和二元響應(yīng)時，這種方法不適用。

2.4 性能曲線

評估可靠性的另一種方法就是建立性能曲線[14]，它是通過采用快速篩選技術(shù)分析不同濃度的樣品而建立的。通常，需制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)的樣品空白，使其最終濃度在標(biāo)準(zhǔn)限量值上下。以中等精度對每個濃度的試樣進行多次重復(fù)測定，對每個濃度水平計算出陽性結(jié)果的數(shù)量，據(jù)此繪制濃度水平與陽性結(jié)果百分比曲線。該曲線可能確定閾值濃度，即對一定的誤差概率，儀器響應(yīng)的濃度高于標(biāo)準(zhǔn)限量值。此外，對一定的誤差概率α和β，還可以計算出不可靠間隔或區(qū)間。

圖2是用前述酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定黃曲霉素B1的性能曲線。為此，需制備5個濃度的加標(biāo)樣品（2個高于標(biāo)準(zhǔn)限量，2個低于標(biāo)準(zhǔn)限量，1個等于2μg/g標(biāo)準(zhǔn)限量），每個濃度重復(fù)測定10次，結(jié)果見表3。分析完成后，計算陽性與陰性結(jié)果的百分?jǐn)?shù)。根據(jù)圖2中假陽性或假陰性出錯的概率，可以確定閾值濃度，該濃度在圖上可用一條垂線表示。根據(jù)出錯概率的不同，該垂線可以左右移動。如果標(biāo)準(zhǔn)限量濃度（2μg/g）的樣品可以接受，那么出錯的可能性約是50%。在定性或快速篩選分析中，通常關(guān)心的是怎樣獲得低的假陰性概率。在這種情況下，閾值水平可設(shè)在1μg/g和1.5μg/g之間。例如，若將閾值濃度設(shè)為1.5μg/g（垂直線），那么有10%的結(jié)果呈假陽性，即可認(rèn)為10個樣品中有1個高于標(biāo)準(zhǔn)限量，而實際上卻低于該限量。

圖2 性能曲線

表3 標(biāo)準(zhǔn)限量附近不同濃度的空白加標(biāo)樣品的分析結(jié)果

為了確定不可靠區(qū)間，假陰性和假陽性率都必須固定。在前例中，如果誤差概率α和β都定為5%，那么不可靠區(qū)間在1.25μg/g和2.4μg/g之間。顯然，性能曲線越準(zhǔn)確，不可靠區(qū)間越窄。而這一點又與每個濃度重復(fù)分析的次數(shù)和濃度水平的數(shù)量有關(guān)。

與貝葉斯定理類似，該法的主要缺點是當(dāng)位于可靠區(qū)間內(nèi)濃度的樣品重復(fù)測定次數(shù)較少時，在有限樣本容量中獲得陽性或陰性結(jié)果的概率也低。此外，考慮到成本和時間，增加重復(fù)次數(shù)會產(chǎn)生一些消極的后果。當(dāng)對現(xiàn)行篩選方法的精度缺乏認(rèn)識，或用試劑盒來分析樣品時，這種方法是有用的，因為試劑盒的響應(yīng)不是陽性就是陰性。當(dāng)獲得可疑結(jié)果時，性能曲線會發(fā)生變化。性能曲線適用范圍廣，適用于所有類型的快速篩選系統(tǒng)。

3 結(jié)束語

定性分析或快速篩選分析中結(jié)果的可靠性評估方法有四種，具體方法的選擇主要取決于分析問題本身以及所用的快速篩選技術(shù)。利用上述方法來估計分析結(jié)果可靠性，實驗所需的樣品數(shù)量和濃度水平都是不同的。如果利用列聯(lián)表估算可靠性，雖然試樣只可能有兩種情況，即高于或低于標(biāo)準(zhǔn)限量值，但分析不同濃度的樣品仍是需要的。同樣，當(dāng)用性能曲線來處理數(shù)據(jù)可靠性，仍需分析不同濃度的樣品，且每個濃度需重復(fù)測定。當(dāng)用統(tǒng)計間隔來估算結(jié)果的可靠性時，只需分析某個濃度的多個樣品。

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