消巖湯不同時段聯(lián)合化療對Lewis肺癌小鼠免疫功能的影響*

賈英杰 ，李小江 ，楊佩穎 ，孫一予 ，張?zhí)N超 ，黃敏娜 ，包芳芳

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康近交系C57BL/6小鼠，64 只，雌性，6～8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，動物合格證號：SCXK（京）2007-0001。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，室溫（20±2）℃，濕度20%～40%。

1.2 細(xì)胞株 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，購自天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

1.3.1 消巖湯 方由黃芪、太子參、夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草、蜂房、姜黃、郁金等藥組成，140 g生藥煎出300 mL湯劑，每1 mL藥液含生藥0.47 g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供生藥并煎煮。按照等效劑量公式，小鼠每日給藥為0.154 L/kg，后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至相應(yīng)倍數(shù)。

1.3.2 注射用順鉑粉針劑 每支20 mg，齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H37021357。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑[Mouse干擾素（IFN-γ）檢測試劑及Mouse白介素-2（IL-2）檢測試劑] 標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)稀釋液各1瓶，精密度微孔板1塊，顯色劑12 mL，終止液6 mL，25倍濃縮液30 mL，辣根過氧化物酶（HRP）稀釋液12mL，抗鼠IFN-γ生物素偶聯(lián)物2瓶，抗鼠IL-2生物素偶聯(lián)物2瓶，標(biāo)記親和素2瓶，生物素稀釋液12 mL等，均購自尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)儀器 萬分之一電子天平；手術(shù)剪；眼科剪；離心機(jī)；低溫冰箱；酶標(biāo)檢測儀；自動平衡離心機(jī)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取小鼠60只，稱質(zhì)量后隨機(jī)分為6組。A組：空白對照組，B組：荷瘤空白對照組，C組：單純順鉑組，D組：化療前7 d天運(yùn)用消巖湯加順鉑組，E組：化療前3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組，F(xiàn)組：消巖湯同時加順鉑組，每組10只。

2.2 Lewis肺癌模型的建立 A組外其余5組進(jìn)行造模。Lewis肺癌瘤株接種于余下4只C57BL/6近交系小鼠右腋部皮下，14 d后，無菌剝離荷瘤小鼠皮下瘤塊，將瘤組織剪碎，研磨，用生理鹽水稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個/L，于B組、C組、D組、E組、F組小鼠右腋部皮下注射接種肺癌瘤株，0.2 mL/只。

2.3 給藥劑量及方法

2.3.1 化療方法 C組、D組、E組、F組小鼠接種肺癌瘤株第7天，用生理鹽水把20 mg順鉑稀釋成0.25 g/L順鉑注射液，小鼠腹腔注射0.2 mL/只，連續(xù)注射5 d。

2.3.2 消巖湯給藥方法 D組化療前7 d開始使用消巖湯，E組化療前3 d開始使用消巖湯，F(xiàn)組化療開始同時使用消巖湯，每日8∶00、17∶00分別予消巖湯灌胃1次。按照等效劑量公式，小鼠每日給藥為0.154 L/kg，連續(xù)給藥至小鼠接種肺癌瘤株后第12天。給藥期間，各組小鼠自由飲水、進(jìn)食。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 小鼠生長活動狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)過程中觀察小鼠的飲食、毛發(fā)、活動、精神狀態(tài)等情況。

2.4.2 小鼠體質(zhì)量變化情況 于開始給藥前1 d給每只小鼠稱體質(zhì)量，于末次給藥后24 h再次稱體質(zhì)量。記錄數(shù)據(jù)，分析。

2.4.3 腫瘤抑制率 末次給藥后24 h，Lewis肺癌小鼠頸椎脫臼處死。處死的小鼠用大頭針仰面固定于塑料泡沫板上，眼科剪分離剝?nèi)∧[瘤，電子天平稱體質(zhì)量，計(jì)算瘤質(zhì)量與瘤腫抑制率。瘤腫抑制率=（l－實(shí)驗(yàn)組平均瘤質(zhì)量/對照組平均瘤質(zhì)量）×100%。

2.4.4 脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)測定 脫頸處死動物后，剝離胸腺及脾臟立即用萬分之一電子天平稱體質(zhì)量，稱體質(zhì)量后分別計(jì)算胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/小鼠質(zhì)量（g）

脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠質(zhì)量（g）

2.4.5 IFN-γ、IL-2含量測定 末次給藥后24 h將各組小鼠摘眼球取血2～3 mL，置于抗凝管內(nèi)，4℃，3000 r/min，離心5 min，取血清置于-20℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，具體操作按尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)（北京）有限公司提供的小鼠IFN-γ ELISA、小鼠IL-2 ELISA試劑盒進(jìn)行檢測，通過血清樣品的OD值可在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2的濃度。本實(shí)驗(yàn)采用計(jì)算機(jī)軟件，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料分別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P＜0.05為顯著性水準(zhǔn)。用單因素方差分析（Oneway ANOVA）比較多組間均值差異。如果差異有顯著性意義，則需要作進(jìn)一步的樣本均數(shù)之間的兩兩比較，用Student Newman Keuls檢測。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 生長一般狀態(tài)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，順鉑組小鼠注射順鉑3 d后表現(xiàn)身材瘦小，活動少，喜群居，進(jìn)食明顯減少，毛發(fā)缺少光澤；各順鉑加消巖湯組脫毛現(xiàn)象少于順鉑組，活動力優(yōu)于順鉑組，其中化療前7 d及3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組效果最佳。

3.2 小鼠體質(zhì)量變化 如表1所示，治療前各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05），具有可比性。治療后，各組小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05），其中與荷瘤空白對照組比較，順鉑組及消巖湯同時加順鉑組體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01），化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組體質(zhì)量明顯下降（P＜0.05）。

3.3 腫瘤抑瘤率 如表1所示，各組小鼠瘤體質(zhì)量具有顯著差異（P＜0.01），其中與荷瘤空白對照組比較，順鉑組瘤質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），其余各組瘤質(zhì)量均顯著下降（P＜0.01）。與單純化療組比較，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組及化療前3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組瘤質(zhì)量明顯下降（P＜0.05）。

表1 治療前后小鼠體質(zhì)量變化情況及瘤體、抑瘤率情況(x±s)Tab.1 Body weight and humor、inhibition rate(x±s)

3.4 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化 如表2所示，各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)具有顯著差異（P＜0.01）。與順鉑組相比，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組、化療前3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組及消巖湯同時加順鉑組均能顯著提高荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)（P＜0.05）；與荷瘤空白對照組相比，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組（P＜0.01）、化療前3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組的胸腺指數(shù)明顯高于荷瘤空白對照組（P＜0.05），具有顯著性差異。在消巖湯提前介入化療中可以看出，提前7 d運(yùn)用中藥均較提前3 d及同時用藥的胸腺指數(shù)升高明顯，有顯著性差異（P＜0.05）。與荷瘤空白對照組相比，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組、化療前3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組的脾臟指數(shù)明顯高于荷瘤空白對照組，具有顯著性差異（P＜0.01）。在消巖湯提前介入化療中可以看出，提前7 d均較提前3 d運(yùn)用中藥脾臟指數(shù)沒有顯著性差異（P＞0.05）。提前7 d運(yùn)用消巖湯較同時用藥脾臟指數(shù)升高，有顯著性差異（P＜0.05）。

3.5 IL-2及IFN-γ的變化 如表2所示：各組小鼠血清IL-2具有顯著差異（P＜0.01）。單純化療組的IL-2水平明顯低于荷瘤空白對照組，具有顯著性差異（P＜0.05）。與順鉑組相比，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組、化療前3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組及消巖湯同時加順鉑組均能顯著提高荷瘤小鼠IL-2水平（P＜0.05）；與荷瘤空白對照組相比，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組的IL-2水平明顯提高（P＜0.01）。而在消巖湯提前介入化療中可以看出，提前7 d運(yùn)用中藥較同時用藥的IL-2水平升高明顯，并具有顯著性差異（P＜0.05）。

表2 各組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及血清IL-2及IFN-γ的變化情況(±s)Tab.2 Mice spleen index,thymus inde and serum IFN-γ,IL-2 content in serum(±s)

表2 各組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及血清IL-2及IFN-γ的變化情況(±s)Tab.2 Mice spleen index,thymus inde and serum IFN-γ,IL-2 content in serum(±s)

注：與單純化療組比較，▲P＜0.05；與荷瘤空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別n ABCDEF 101010101010胸腺指數(shù)（g/kg）2.069±0.1882.004±0.1321.863±0.1062.447±0.291▲**2.218±0.249▲*2.134±0.157▲脾臟指數(shù)（g/kg）8.024±0.2527.850±0.2357.556±0.323*8.445±0.262▲**8.235±0.232▲**8.056±0.192▲IFN-γ（u/L）108.11±9.53101.35±6.1787.25±5.97114.38±5.89▲**106.06±7.43▲*101.72±9.42▲IL-2（u/L）92.80±6.4588.35±6.1778.25±6.6696.38±5.82▲**91.96±6.24▲*84.72±6.86▲

如表2所示：各組小鼠血清IFN-γ具有顯著差異（P＜0.01）。單純化療組的IFN-γ水平明顯低于荷瘤空白對照組，具有顯著性差異（P＜0.05）。與順鉑組相比，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組、化療前3 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組及消巖湯同時加順鉑組均能顯著提高荷瘤小鼠IFN-γ水平（P＜0.05）；與荷瘤空白對照組相比，化療前7 d運(yùn)用消巖湯加順鉑組的IFN-γ水平明顯提高（P＜0.01）。而在消巖湯提前介入化療中可以看出，提前7 d運(yùn)用中藥較提前3 d運(yùn)用中藥及同時用藥的IFN-γ水平升高明顯，并具有顯著性差異（P＜0.05）。

4 小結(jié)

通過動物實(shí)驗(yàn)觀察，結(jié)果顯示消巖湯在提高Lewis肺癌小鼠免疫器官及細(xì)胞免疫功能方面有良好的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，消巖湯提前介入化療對Lewis肺癌小鼠有較好的抑瘤作用，生長活動狀況也較好，較單純化療有顯著性差異。單純化療小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)較荷瘤空白對照組及空白組小鼠低下，化療前運(yùn)用消巖湯介入治療lewis肺癌小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)較單純化療小鼠升高，具有顯著性差異。IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子在介導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫過程中起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單純化療組IL-2、IFN-γ細(xì)胞因子活性均顯著低于正常對照組及荷瘤空白對照組。而在化療前運(yùn)用消巖湯配合化療，IL-2、IFN-γ細(xì)胞因子分泌水平顯著高于單純化療組。其中，提前7 d運(yùn)用消巖湯配合化療療效更好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示消巖湯能保護(hù)實(shí)驗(yàn)動物的細(xì)胞免疫器官，提高小鼠的免疫功能。