• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紅花多糖對(duì)人PBMC增殖活性及分泌細(xì)胞因子的影響*

    2010-07-13 07:23:56石學(xué)魁阮殿清周明瑤王亞賢
    天津中醫(yī)藥 2010年4期
    關(guān)鍵詞:凝集素紅花孵育

    石學(xué)魁,阮殿清,陶 冀,周明瑤,王亞賢

    (1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,牡丹江 157011;2.木蘭縣疾病控制中心,哈爾濱 151900;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室,哈爾濱 150040)

    紅花是一味重要的活血化瘀藥,具有活血、祛瘀、止痛之功效,在歷代醫(yī)書及《本草綱目》中均有詳細(xì)記載,是傳統(tǒng)復(fù)方和現(xiàn)代臨床組方中常用的中藥。紅花成分復(fù)雜,作用多樣。據(jù)研究,紅花的重要成分之一——紅花多糖(SPS)具有免疫調(diào)節(jié)功能,如增加溶血空斑數(shù)量,并能顯著對(duì)抗?jié)娔崴梢种迫苎瞻叩淖饔肹1];紅花多糖也具有抗腫瘤作用[2]。本研究通過檢測(cè)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的增殖作用及PBMC誘生細(xì)胞因子水平,探討SPS對(duì)機(jī)體免疫功能的影響,以期為該藥應(yīng)用于抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 細(xì)胞株 小鼠T細(xì)胞(CTLL-2,協(xié)和醫(yī)科大學(xué)免疫室惠贈(zèng))、人羊膜上皮細(xì)胞(WISH,衛(wèi)生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈(zèng))、小鼠成纖維細(xì)胞(L929,空軍總院劉麗博士惠贈(zèng))。

    1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO-BRL公司);胎牛血清(FCS,GIBCO-BRL公司);Ficoll-Urografin淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠);植物凝集素 P(PHA-P,Serva產(chǎn)品);水皰口炎病毒(VSV,衛(wèi)生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈(zèng));重組白細(xì)胞介素-2(rIL-2,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院中化技術(shù)研究所張明偉教授惠贈(zèng));重組腫瘤壞死因子α(rTNF-α)和基因重組干擾素γ(rIFN-γ,邦定生物醫(yī)學(xué)公司);氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR):比放射活性100 mci/mL(中科院原子能所提供)。

    1.3 儀器和設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(池本理化株式會(huì)社,日本);倒置顯微鏡(Olympus,日本);酶標(biāo)微量板測(cè)定儀(BIO-T EK INSTRMENTS INC.,美國(guó))。

    1.4 紅花多糖的制備 紅花1000g,充分浸漬,90℃提取4 h,邊提邊攪拌,過濾,殘?jiān)貜?fù)提取1次,合并兩次提取液濃縮至一定體積,加乙醇終濃度至85%。沉淀物加適量水溶解,置分液漏斗中,加氯仿充分振蕩,放置片刻,除去氯仿層,如此反復(fù)操作6次,以除去蛋白質(zhì)。水層加95%乙醇沉淀,沉淀物先后用無水乙醇、乙醚洗滌3次,干燥后即得SPS。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)前配制成不同濃度的多糖水溶液,無菌過濾后冰箱保存。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 PBMC的分離 取健康人外周抗凝血5 mL,用淋巴細(xì)胞分離液,按常規(guī)方法分離PBMC。將分離出的細(xì)胞用5 mL RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3遍,制成細(xì)胞懸液(1×109個(gè)/L)。

    2.2 PBMC增殖活性檢測(cè) 于96孔圓底培養(yǎng)板中每孔加入1×105個(gè)人PBMC,分為正常對(duì)照組(不加紅花多糖或PHA),植物血球凝集素(PHA)刺激組(PHA終濃度為1g/L),PHA加多糖組(PHA終濃度為1 g/L,紅花多糖濃度為 1.25 g/L),多糖組 1(5 g/L),多糖組2(2.5g/L),多糖組 3(1.25 g/L),多糖組 4(0.625 g/L),多糖組5(0.312 g/L)。每孔液量為200 μL,作平行3孔。培養(yǎng) 72 h,每孔加3H-TdR 10 μL ,孵育 6 h。用液閃儀測(cè)定3H-TdR摻入量,結(jié)果以每分鐘脈沖數(shù)(cpm)表示。

    2.3 細(xì)胞因子生物活性檢測(cè) 于24孔板中每孔加入1×106個(gè)PBMC,分組同2.2。每孔總液量為1 mL,每5孔為1個(gè)實(shí)驗(yàn)組。刺激48h,每孔取上清500μL,分裝5份檢測(cè)細(xì)胞因子。

    2.3.1 白介素-2(IL-2)生物活性檢測(cè) 取CTLL-2細(xì)胞,洗滌3次,以完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至2×109個(gè)/L,按每孔75 μL加入96孔平底培養(yǎng)板中。將IL-2標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋8個(gè)梯度,最大濃度為4×105U/L,每孔25μL,設(shè)平行3孔。另取培養(yǎng)上清25μL加入孔中,每份樣品設(shè)復(fù)孔。對(duì)照孔加完全培養(yǎng)基25 μL。5%二氧化碳(CO2)孵箱中孵育 20~22 h,待對(duì)照孔細(xì)胞死亡大于90%后,每孔加入噻唑藍(lán)(MTT)15 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加溶解液 100 μL,置孵箱中孵育8 h后,酶標(biāo)儀上測(cè)其光密度值(OD值),測(cè)定波長(zhǎng)570 nm,參考波長(zhǎng)630 nm。

    2.3.2 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)生物活性檢測(cè)培養(yǎng)的L929細(xì)胞,用0.25%的胰酶消化,收集細(xì)胞,洗滌2次,用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為3×108個(gè)/L。按每孔90 μL細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中,孵箱中孵育18h細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,加放線菌素D 10 μL(終濃度800 μg/L)。將TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品5倍稀釋8個(gè)梯度,最大濃度為2×108U/L,每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清樣品10 μL。酶標(biāo)儀檢測(cè)同IL-2。

    2.3.3 干擾素-γ(IFN-γ)生物活性檢測(cè) 用0.25%的胰酶消化培養(yǎng)的羊膜(WISH)細(xì)胞,洗滌2次調(diào)細(xì)胞濃度為3×108個(gè)/L,96孔平底培養(yǎng)板中每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL,5%CO2孵箱中孵育2 h。標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋8個(gè)梯度,最大濃度為5×106U/L,每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清25 μL,培養(yǎng)過夜,以每孔100 TCID50水泡性口腔炎病毒(VSV)攻擊WISH細(xì)胞,再孵育24 h,待對(duì)照組細(xì)胞病變大于75%時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。以下MTT測(cè)定同IL-2測(cè)定。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 SPS對(duì)人PBMC增殖活性的影響 經(jīng)SPS作用后,PBMC增殖活性均比正常對(duì)照組高,尤以1.25g/L和0.625 g/L劑量組作用顯著(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用,最適宜促進(jìn)效應(yīng)濃度為0.625 g/L。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較,未見明顯差異,表明SPS對(duì)PHA所致的PBMC增殖反應(yīng)無協(xié)同或拮抗作用。PHA組與SPS各組比較差異顯著,說明SPS雖然對(duì)PBMC的增殖有促進(jìn)作用,但作用程度遠(yuǎn)低于PHA。見表1。

    表1 SPS對(duì)人PBMC增殖的影響(n=7,±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7,±s)

    表1 SPS對(duì)人PBMC增殖的影響(n=7,±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7,±s)

    注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別正常對(duì)照組植物凝集素對(duì)照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.2552.51.250.6250.312每分鐘脈沖數(shù)(cpm)851± 27240398±8727**32950±6142**1131± 2881373± 3452518± 595*4508±1088*1195± 310

    3.2 SPS對(duì)PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響 SPS對(duì)IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生有明顯的誘導(dǎo)作用,與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05),但其作用不及PHA(與正常對(duì)照組比較P<0.01)。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較,未見明顯差異,表明SPS對(duì)PHA刺激PBMC產(chǎn)生IL-2和IFN-γ無協(xié)同或拮抗作用。TNF-α 各組之間無顯著性差異(P>0.05),即 SPS對(duì)TNF-α的分泌無明顯誘導(dǎo)作用。見表2。

    表2 不同濃度SPS對(duì)PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響(n=7,±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7,±s)103U/L

    表2 不同濃度SPS對(duì)PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響(n=7,±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7,±s)103U/L

    注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別正常對(duì)照組植物凝集素對(duì)照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.251.250.6250.312 IL-216.45±3.3462.56±13.89**64.57±14.28**38.78±7.98*44.54±9.23*34.12±6.54*IFN-γ 23.55±4.43157.44±29.69**148.67±27.87**76.45±13.87*98.65±17.45*88.43±16.13*TNF-α 5.66±1.766.12±2.346.67±2.894.30±1.454.98±1.895.54±2.86

    4 討論

    紅花具有抗腫瘤作用,在于其活血、祛瘀、止痛之功效。腫瘤在中醫(yī)學(xué)中相當(dāng)于噎膈、癥積、石瘕、痞癖、腸覃、肚腹結(jié)塊等,且歷代醫(yī)家也多認(rèn)為腫瘤與瘀血有密切關(guān)系,如王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中指出:“肚腹結(jié)塊者,必有形之血?!闭f腹內(nèi)腫塊,多由血瘀所致,故活血化瘀法是治療腫瘤的主要法則之一。在多種癌癥的臨床治療中以紅花為主藥單用或適當(dāng)配伍,常常獲得良好療效,原因在于此。紅花多糖是紅花的主要成分之一,作為免疫調(diào)節(jié)劑具有抗腫瘤作用。本研究紅花多糖(SPS)對(duì)PBMC的增殖及PBMC分泌細(xì)胞因子的影響,探討其免疫調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步研究紅花多糖的抗腫瘤機(jī)制打下基礎(chǔ)。

    PBMC主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,而以T細(xì)胞占多數(shù)。T細(xì)胞承擔(dān)著抗微生物、移植物排斥和腫瘤的免疫監(jiān)視等一系列重要生理功能,是細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者,在體內(nèi)通過分泌IL-2而發(fā)揮一系列重要的免疫效應(yīng)。IL-2主要由CD4、CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生,可激活單核/巨噬細(xì)胞,并增強(qiáng)其殺瘤活性;促進(jìn)自然殺傷(NK)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性及產(chǎn)生細(xì)胞因子,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)增生;激活B細(xì)胞及產(chǎn)生抗體等。淋巴細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞(IFN-γ)能促進(jìn)CTL成熟及活性;激活NK細(xì)胞殺傷活性;激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其活性。研究發(fā)現(xiàn),許多中藥多糖及中藥提取物就是通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及誘生細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[3-5]。有些中藥復(fù)方也能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及提高細(xì)胞因子如IL-2的分泌[6]。實(shí)驗(yàn)中,SPS促進(jìn)PBMC的增殖,進(jìn)而增強(qiáng)其活性,有助于提高機(jī)體的細(xì)胞免疫,發(fā)揮抗腫瘤、抗感染等作用。SPS誘導(dǎo)PBMC分泌大量細(xì)胞因子,尤其是1.25 g/L和0.625 g/L劑量作用顯著。說明SPS具有明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化以及促進(jìn)內(nèi)源性IL-2、IFN-γ的產(chǎn)生。其結(jié)果表明這些細(xì)胞因子是SPS發(fā)揮藥效的分子介質(zhì)和物質(zhì)基礎(chǔ),是增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種有害因素的非特異性抵抗力的藥效機(jī)制之一。

    另外,SPS對(duì)TNF-α的分泌無明顯誘導(dǎo)作用,其原因?qū)⑦M(jìn)一步研究。

    綜上所述,紅花多糖(SPS)可促進(jìn)人PBMC增殖,提高PBMC分泌IFN-γ、IL-2,具有免疫調(diào)節(jié)作用。因此,SPS可作為免疫調(diào)節(jié)劑而用于腫瘤治療。

    [1] 黃 虹,俞曼雷,翟世康.等.紅花多糖的免活性作用[J].現(xiàn)代免疫學(xué),1982,2(6):7-8.

    [2] 何素芳,王志剛,任愛農(nóng),等.紅花多糖對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及瘤細(xì)胞VEGF,Ki67表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(6):795-797.

    [3] 魏志文,高曉雯,鄭維發(fā).芫花根總黃酮抗腫瘤活性研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(2):116-119.

    [4] 祝 絢,鮑依稀,李 進(jìn),等.云芝糖肽、丹參酮ⅡA對(duì)荷瘤小鼠的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2008,24(6):526-529.

    [5] 王冬艷,張洪泉.中藥誘生內(nèi)源性IL-2、增強(qiáng)免疫功能及抗腫瘤作用研究概況[J].藥學(xué)進(jìn)展,2006,30(4):162-165.

    [6] 楊志強(qiáng),王潤(rùn)田,崔 澂,等.中藥復(fù)方抑瘤飲影響荷S180瘤小鼠免疫功能的動(dòng)態(tài)研究[J].現(xiàn)代免疫學(xué),2006,26(1):65-68.

    猜你喜歡
    凝集素紅花孵育
    紅花榜
    紅花榜
    紅花榜
    紅花榜
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測(cè)定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    半乳糖凝集素-3與心力衰竭相關(guān)性
    半乳糖凝集素-3在心力衰竭中的研究進(jìn)展
    半乳糖凝集素3與急性缺血性腦卒中的相關(guān)性研究
    小说图片视频综合网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 99精品久久久久人妻精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲av熟女| 高清毛片免费观看视频网站| 男女那种视频在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美午夜高清在线| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲欧美日韩东京热| 精品人妻1区二区| av有码第一页| 免费在线观看成人毛片| 看黄色毛片网站| 亚洲av片天天在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 美女大奶头视频| 国产精品影院久久| 午夜福利在线在线| 好男人电影高清在线观看| 午夜福利在线在线| 最好的美女福利视频网| 日韩成人在线观看一区二区三区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| av欧美777| 丰满的人妻完整版| 深夜精品福利| 亚洲熟妇熟女久久| 色综合站精品国产| 一进一出好大好爽视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 午夜精品在线福利| 麻豆一二三区av精品| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人欧美大片| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久精品综合一区二区三区| 美女 人体艺术 gogo| 成人欧美大片| 在线视频色国产色| 国产精品久久视频播放| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 少妇粗大呻吟视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 女警被强在线播放| 欧美乱色亚洲激情| 久久这里只有精品中国| 老鸭窝网址在线观看| 99热这里只有精品一区 | 日本成人三级电影网站| 88av欧美| 99久久国产精品久久久| 无限看片的www在线观看| 国产野战对白在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 中文在线观看免费www的网站 | 一进一出抽搐动态| 一级毛片精品| 午夜福利18| 免费看美女性在线毛片视频| 99热这里只有精品一区 | 国产高清视频在线播放一区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 美女免费视频网站| 夜夜爽天天搞| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日本黄大片高清| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美日韩一级在线毛片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜福利18| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美大码av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 免费在线观看亚洲国产| 国产黄片美女视频| 99在线人妻在线中文字幕| 99精品久久久久人妻精品| 国产1区2区3区精品| 亚洲全国av大片| 久久久久久大精品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美日韩一级在线毛片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 99riav亚洲国产免费| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费人成视频x8x8入口观看| 九色国产91popny在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产伦在线观看视频一区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 91麻豆精品激情在线观看国产| 大型av网站在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产男靠女视频免费网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 后天国语完整版免费观看| 一本精品99久久精品77| 国产亚洲av高清不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄色视频不卡| 亚洲精华国产精华精| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 欧美日韩国产亚洲二区| 悠悠久久av| 久久精品影院6| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 最新美女视频免费是黄的| 国产亚洲av高清不卡| av在线播放免费不卡| 两个人视频免费观看高清| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲av成人精品一区久久| 在线a可以看的网站| 丰满的人妻完整版| av视频在线观看入口| 夜夜夜夜夜久久久久| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国内精品一区二区在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 一本久久中文字幕| 性欧美人与动物交配| 成人一区二区视频在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 三级国产精品欧美在线观看 | 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲国产精品成人综合色| 国内精品久久久久久久电影| 精品国产乱子伦一区二区三区| 精品不卡国产一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 两性夫妻黄色片| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产黄片美女视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲第一电影网av| av天堂在线播放| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产高清视频在线播放一区| 一级片免费观看大全| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲一码二码三码区别大吗| 麻豆一二三区av精品| www日本黄色视频网| 99riav亚洲国产免费| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产高清激情床上av| 香蕉国产在线看| 91在线观看av| 99精品欧美一区二区三区四区| aaaaa片日本免费| 婷婷亚洲欧美| 90打野战视频偷拍视频| www.熟女人妻精品国产| 免费看a级黄色片| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 午夜影院日韩av| a级毛片在线看网站| 脱女人内裤的视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产亚洲精品久久久久5区| 午夜久久久久精精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲avbb在线观看| 嫩草影视91久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 女警被强在线播放| 国产精品亚洲一级av第二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 男女那种视频在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲av五月六月丁香网| 舔av片在线| 黄色丝袜av网址大全| 神马国产精品三级电影在线观看 | 黄色 视频免费看| 亚洲七黄色美女视频| 91老司机精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲人与动物交配视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 大型av网站在线播放| 可以在线观看毛片的网站| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美色视频一区免费| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 91成年电影在线观看| 高清在线国产一区| 美女免费视频网站| 免费在线观看成人毛片| 成人av一区二区三区在线看| 在线观看午夜福利视频| 亚洲最大成人中文| 极品教师在线免费播放| 日日爽夜夜爽网站| 久久久久久久久久黄片| 亚洲第一电影网av| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产午夜精品久久久久久| 成人三级做爰电影| 精品人妻1区二区| 国产精华一区二区三区| 免费无遮挡裸体视频| av有码第一页| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 成人av一区二区三区在线看| 久久性视频一级片| 免费无遮挡裸体视频| 午夜福利免费观看在线| 久久久精品大字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产69精品久久久久777片 | 国产精品精品国产色婷婷| 男女那种视频在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| xxxwww97欧美| 999精品在线视频| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲九九香蕉| 波多野结衣巨乳人妻| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 91字幕亚洲| 久久久久国内视频| 午夜激情av网站| 嫩草影院精品99| xxx96com| 欧美午夜高清在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产精品sss在线观看| 在线观看午夜福利视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 嫩草影院精品99| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久久性生活片| 少妇粗大呻吟视频| 麻豆国产av国片精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品国产乱码久久久久久男人| 成人欧美大片| 哪里可以看免费的av片| 午夜精品一区二区三区免费看| 在线观看一区二区三区| 欧美3d第一页| 免费看a级黄色片| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产乱人伦免费视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲成人国产一区在线观看| svipshipincom国产片| 国产成人系列免费观看| 成人国语在线视频| 色在线成人网| xxxwww97欧美| 亚洲真实伦在线观看| 最近在线观看免费完整版| 久久国产精品影院| 国产成人精品无人区| 亚洲国产欧美网| 一二三四社区在线视频社区8| √禁漫天堂资源中文www| 一区二区三区高清视频在线| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 97碰自拍视频| 久久香蕉国产精品| 精品无人区乱码1区二区| 久久精品国产综合久久久| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美黑人巨大hd| 一本综合久久免费| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产一区二区在线av高清观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| 狂野欧美激情性xxxx| 午夜免费成人在线视频| 操出白浆在线播放| 我的老师免费观看完整版| 午夜免费激情av| av福利片在线观看| 久久久久国内视频| 一区二区三区激情视频| 午夜免费激情av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩高清综合在线| 全区人妻精品视频| 成年人黄色毛片网站| 在线观看免费视频日本深夜| 俺也久久电影网| 一级黄色大片毛片| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产伦人伦偷精品视频| 特级一级黄色大片| 性色av乱码一区二区三区2| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲无线在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜福利免费观看在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 午夜免费成人在线视频| 国产69精品久久久久777片 | 欧美zozozo另类| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品精品国产色婷婷| 在线国产一区二区在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产片内射在线| 99久久精品热视频| 国产精品永久免费网站| 丰满人妻一区二区三区视频av | 青草久久国产| 999久久久精品免费观看国产| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久99久视频精品免费| ponron亚洲| 久99久视频精品免费| 午夜福利高清视频| 国产日本99.免费观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲美女黄片视频| 精品久久蜜臀av无| 国产高清激情床上av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲国产看品久久| 色尼玛亚洲综合影院| 少妇被粗大的猛进出69影院| 欧美久久黑人一区二区| 长腿黑丝高跟| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 黄色a级毛片大全视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久免费精品人妻一区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 日本熟妇午夜| 精品久久久久久久末码| 国产视频一区二区在线看| 男插女下体视频免费在线播放| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜精品在线福利| 一进一出抽搐gif免费好疼| 日本一区二区免费在线视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 首页视频小说图片口味搜索| www日本黄色视频网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜a级毛片| svipshipincom国产片| 午夜免费观看网址| 国产99久久九九免费精品| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线国产一区二区在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 手机成人av网站| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一本久久中文字幕| 国产精品综合久久久久久久免费| 很黄的视频免费| 久久久国产欧美日韩av| √禁漫天堂资源中文www| 1024香蕉在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 露出奶头的视频| 国产熟女xx| 一夜夜www| 国产精品国产高清国产av| 母亲3免费完整高清在线观看| av免费在线观看网站| 久久久久国内视频| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产成人系列免费观看| 国产片内射在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 人人妻人人看人人澡| 极品教师在线免费播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久人人人人人| 成人国语在线视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 少妇的丰满在线观看| 久久人人精品亚洲av| 欧美极品一区二区三区四区| 在线免费观看的www视频| 脱女人内裤的视频| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜激情av网站| 桃红色精品国产亚洲av| 精品国产亚洲在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产一区二区在线观看日韩 | a在线观看视频网站| 亚洲成人久久性| 国产成人av教育| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产高清videossex| 国产精品一区二区三区四区久久| 看黄色毛片网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久香蕉精品热| 在线观看日韩欧美| 亚洲乱码一区二区免费版| 99热这里只有精品一区 | 黄色视频不卡| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜视频精品福利| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜亚洲福利在线播放| 日本成人三级电影网站| 女警被强在线播放| www日本黄色视频网| 中文在线观看免费www的网站 | 欧美日韩瑟瑟在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看| 午夜福利高清视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产91精品成人一区二区三区| 可以在线观看毛片的网站| 日韩欧美免费精品| 久久国产精品影院| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品久久久久久久久久久久久| 国产午夜精品久久久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久精品91无色码中文字幕| 男人舔女人的私密视频| 欧美极品一区二区三区四区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产午夜精品论理片| 精品久久久久久久末码| 亚洲全国av大片| 婷婷丁香在线五月| 天堂动漫精品| 欧美日韩国产亚洲二区| a在线观看视频网站| 嫩草影视91久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 深夜精品福利| 国产精品亚洲美女久久久| 在线观看午夜福利视频| 男人舔奶头视频| 99热这里只有精品一区 | 国产黄色小视频在线观看| 在线a可以看的网站| 在线观看免费午夜福利视频| 五月伊人婷婷丁香| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 天天添夜夜摸| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| bbb黄色大片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日日夜夜操网爽| 欧美成人性av电影在线观看| 国产99白浆流出| 成人国语在线视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美乱色亚洲激情| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 在线播放国产精品三级| 九九热线精品视视频播放| 欧美日韩精品网址| 女警被强在线播放| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 丁香六月欧美| 大型av网站在线播放| 亚洲成人久久性| 欧美成人免费av一区二区三区| www.999成人在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 毛片女人毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 99热这里只有是精品50| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美三级亚洲精品| 免费看日本二区| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲专区字幕在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 在线视频色国产色| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 悠悠久久av| 欧美极品一区二区三区四区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国内精品一区二区在线观看| 久久香蕉激情| 一区福利在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 麻豆av在线久日| 日本五十路高清| 最近最新中文字幕大全电影3| 嫩草影院精品99| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费在线观看完整版高清| 国产伦一二天堂av在线观看| 一本一本综合久久| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一级毛片精品| 精品久久久久久久末码| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| 狠狠狠狠99中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产成人啪精品午夜网站| 91成年电影在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| av片东京热男人的天堂| 日本精品一区二区三区蜜桃| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美激情久久久久久爽电影| 99精品久久久久人妻精品| 在线观看一区二区三区| 色综合婷婷激情| 午夜免费激情av| 搡老岳熟女国产| 黄色毛片三级朝国网站| 中国美女看黄片| 亚洲自拍偷在线| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| cao死你这个sao货| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日韩欧美国产在线观看| 黄频高清免费视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色视频,在线免费观看| 国产一区二区三区视频了| 美女扒开内裤让男人捅视频| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 黄色成人免费大全| 成人国语在线视频| 麻豆国产97在线/欧美 | 亚洲av熟女| 波多野结衣高清无吗| 亚洲人成网站高清观看| 日韩av在线大香蕉| 亚洲真实伦在线观看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 最好的美女福利视频网| 脱女人内裤的视频| 免费看十八禁软件| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 男男h啪啪无遮挡| 青草久久国产| 久久亚洲精品不卡| 国产伦一二天堂av在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 免费电影在线观看免费观看| 色老头精品视频在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区|