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    紅花多糖對(duì)人PBMC增殖活性及分泌細(xì)胞因子的影響*

    2010-07-13 07:23:56石學(xué)魁阮殿清周明瑤王亞賢
    天津中醫(yī)藥 2010年4期
    關(guān)鍵詞:凝集素紅花孵育

    石學(xué)魁,阮殿清,陶 冀,周明瑤,王亞賢

    (1.牡丹江醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,牡丹江 157011;2.木蘭縣疾病控制中心,哈爾濱 151900;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室,哈爾濱 150040)

    紅花是一味重要的活血化瘀藥,具有活血、祛瘀、止痛之功效,在歷代醫(yī)書及《本草綱目》中均有詳細(xì)記載,是傳統(tǒng)復(fù)方和現(xiàn)代臨床組方中常用的中藥。紅花成分復(fù)雜,作用多樣。據(jù)研究,紅花的重要成分之一——紅花多糖(SPS)具有免疫調(diào)節(jié)功能,如增加溶血空斑數(shù)量,并能顯著對(duì)抗?jié)娔崴梢种迫苎瞻叩淖饔肹1];紅花多糖也具有抗腫瘤作用[2]。本研究通過檢測(cè)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的增殖作用及PBMC誘生細(xì)胞因子水平,探討SPS對(duì)機(jī)體免疫功能的影響,以期為該藥應(yīng)用于抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 細(xì)胞株 小鼠T細(xì)胞(CTLL-2,協(xié)和醫(yī)科大學(xué)免疫室惠贈(zèng))、人羊膜上皮細(xì)胞(WISH,衛(wèi)生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈(zèng))、小鼠成纖維細(xì)胞(L929,空軍總院劉麗博士惠贈(zèng))。

    1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO-BRL公司);胎牛血清(FCS,GIBCO-BRL公司);Ficoll-Urografin淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠);植物凝集素 P(PHA-P,Serva產(chǎn)品);水皰口炎病毒(VSV,衛(wèi)生部藥品檢定所劉蘭教授惠贈(zèng));重組白細(xì)胞介素-2(rIL-2,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院中化技術(shù)研究所張明偉教授惠贈(zèng));重組腫瘤壞死因子α(rTNF-α)和基因重組干擾素γ(rIFN-γ,邦定生物醫(yī)學(xué)公司);氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷(3H-TdR):比放射活性100 mci/mL(中科院原子能所提供)。

    1.3 儀器和設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(池本理化株式會(huì)社,日本);倒置顯微鏡(Olympus,日本);酶標(biāo)微量板測(cè)定儀(BIO-T EK INSTRMENTS INC.,美國(guó))。

    1.4 紅花多糖的制備 紅花1000g,充分浸漬,90℃提取4 h,邊提邊攪拌,過濾,殘?jiān)貜?fù)提取1次,合并兩次提取液濃縮至一定體積,加乙醇終濃度至85%。沉淀物加適量水溶解,置分液漏斗中,加氯仿充分振蕩,放置片刻,除去氯仿層,如此反復(fù)操作6次,以除去蛋白質(zhì)。水層加95%乙醇沉淀,沉淀物先后用無水乙醇、乙醚洗滌3次,干燥后即得SPS。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)前配制成不同濃度的多糖水溶液,無菌過濾后冰箱保存。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 PBMC的分離 取健康人外周抗凝血5 mL,用淋巴細(xì)胞分離液,按常規(guī)方法分離PBMC。將分離出的細(xì)胞用5 mL RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌3遍,制成細(xì)胞懸液(1×109個(gè)/L)。

    2.2 PBMC增殖活性檢測(cè) 于96孔圓底培養(yǎng)板中每孔加入1×105個(gè)人PBMC,分為正常對(duì)照組(不加紅花多糖或PHA),植物血球凝集素(PHA)刺激組(PHA終濃度為1g/L),PHA加多糖組(PHA終濃度為1 g/L,紅花多糖濃度為 1.25 g/L),多糖組 1(5 g/L),多糖組2(2.5g/L),多糖組 3(1.25 g/L),多糖組 4(0.625 g/L),多糖組5(0.312 g/L)。每孔液量為200 μL,作平行3孔。培養(yǎng) 72 h,每孔加3H-TdR 10 μL ,孵育 6 h。用液閃儀測(cè)定3H-TdR摻入量,結(jié)果以每分鐘脈沖數(shù)(cpm)表示。

    2.3 細(xì)胞因子生物活性檢測(cè) 于24孔板中每孔加入1×106個(gè)PBMC,分組同2.2。每孔總液量為1 mL,每5孔為1個(gè)實(shí)驗(yàn)組。刺激48h,每孔取上清500μL,分裝5份檢測(cè)細(xì)胞因子。

    2.3.1 白介素-2(IL-2)生物活性檢測(cè) 取CTLL-2細(xì)胞,洗滌3次,以完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至2×109個(gè)/L,按每孔75 μL加入96孔平底培養(yǎng)板中。將IL-2標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋8個(gè)梯度,最大濃度為4×105U/L,每孔25μL,設(shè)平行3孔。另取培養(yǎng)上清25μL加入孔中,每份樣品設(shè)復(fù)孔。對(duì)照孔加完全培養(yǎng)基25 μL。5%二氧化碳(CO2)孵箱中孵育 20~22 h,待對(duì)照孔細(xì)胞死亡大于90%后,每孔加入噻唑藍(lán)(MTT)15 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,每孔加溶解液 100 μL,置孵箱中孵育8 h后,酶標(biāo)儀上測(cè)其光密度值(OD值),測(cè)定波長(zhǎng)570 nm,參考波長(zhǎng)630 nm。

    2.3.2 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)生物活性檢測(cè)培養(yǎng)的L929細(xì)胞,用0.25%的胰酶消化,收集細(xì)胞,洗滌2次,用完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為3×108個(gè)/L。按每孔90 μL細(xì)胞懸液加入96孔平底培養(yǎng)板中,孵箱中孵育18h細(xì)胞長(zhǎng)成單層后,加放線菌素D 10 μL(終濃度800 μg/L)。將TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品5倍稀釋8個(gè)梯度,最大濃度為2×108U/L,每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清樣品10 μL。酶標(biāo)儀檢測(cè)同IL-2。

    2.3.3 干擾素-γ(IFN-γ)生物活性檢測(cè) 用0.25%的胰酶消化培養(yǎng)的羊膜(WISH)細(xì)胞,洗滌2次調(diào)細(xì)胞濃度為3×108個(gè)/L,96孔平底培養(yǎng)板中每孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL,5%CO2孵箱中孵育2 h。標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋8個(gè)梯度,最大濃度為5×106U/L,每孔加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)上清25 μL,培養(yǎng)過夜,以每孔100 TCID50水泡性口腔炎病毒(VSV)攻擊WISH細(xì)胞,再孵育24 h,待對(duì)照組細(xì)胞病變大于75%時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。以下MTT測(cè)定同IL-2測(cè)定。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 SPS對(duì)人PBMC增殖活性的影響 經(jīng)SPS作用后,PBMC增殖活性均比正常對(duì)照組高,尤以1.25g/L和0.625 g/L劑量組作用顯著(P<0.05),呈現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用,最適宜促進(jìn)效應(yīng)濃度為0.625 g/L。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較,未見明顯差異,表明SPS對(duì)PHA所致的PBMC增殖反應(yīng)無協(xié)同或拮抗作用。PHA組與SPS各組比較差異顯著,說明SPS雖然對(duì)PBMC的增殖有促進(jìn)作用,但作用程度遠(yuǎn)低于PHA。見表1。

    表1 SPS對(duì)人PBMC增殖的影響(n=7,±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7,±s)

    表1 SPS對(duì)人PBMC增殖的影響(n=7,±s)Tab 1 The influence of SPS on the proliferation of PBMC in human body(n=7,±s)

    注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別正常對(duì)照組植物凝集素對(duì)照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.2552.51.250.6250.312每分鐘脈沖數(shù)(cpm)851± 27240398±8727**32950±6142**1131± 2881373± 3452518± 595*4508±1088*1195± 310

    3.2 SPS對(duì)PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響 SPS對(duì)IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生有明顯的誘導(dǎo)作用,與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05),但其作用不及PHA(與正常對(duì)照組比較P<0.01)。PHA和PHA+SPS 1.25 g/L組比較,未見明顯差異,表明SPS對(duì)PHA刺激PBMC產(chǎn)生IL-2和IFN-γ無協(xié)同或拮抗作用。TNF-α 各組之間無顯著性差異(P>0.05),即 SPS對(duì)TNF-α的分泌無明顯誘導(dǎo)作用。見表2。

    表2 不同濃度SPS對(duì)PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響(n=7,±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7,±s)103U/L

    表2 不同濃度SPS對(duì)PBMC產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響(n=7,±s)Tab.2 The influence of different concentration of SPS on the cytokines release produced by PBMC in vitro(n=7,±s)103U/L

    注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別正常對(duì)照組植物凝集素對(duì)照組植物凝集素+紅花多糖組紅花多糖組紅花多糖(g/L)001.251.250.6250.312 IL-216.45±3.3462.56±13.89**64.57±14.28**38.78±7.98*44.54±9.23*34.12±6.54*IFN-γ 23.55±4.43157.44±29.69**148.67±27.87**76.45±13.87*98.65±17.45*88.43±16.13*TNF-α 5.66±1.766.12±2.346.67±2.894.30±1.454.98±1.895.54±2.86

    4 討論

    紅花具有抗腫瘤作用,在于其活血、祛瘀、止痛之功效。腫瘤在中醫(yī)學(xué)中相當(dāng)于噎膈、癥積、石瘕、痞癖、腸覃、肚腹結(jié)塊等,且歷代醫(yī)家也多認(rèn)為腫瘤與瘀血有密切關(guān)系,如王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中指出:“肚腹結(jié)塊者,必有形之血?!闭f腹內(nèi)腫塊,多由血瘀所致,故活血化瘀法是治療腫瘤的主要法則之一。在多種癌癥的臨床治療中以紅花為主藥單用或適當(dāng)配伍,常常獲得良好療效,原因在于此。紅花多糖是紅花的主要成分之一,作為免疫調(diào)節(jié)劑具有抗腫瘤作用。本研究紅花多糖(SPS)對(duì)PBMC的增殖及PBMC分泌細(xì)胞因子的影響,探討其免疫調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步研究紅花多糖的抗腫瘤機(jī)制打下基礎(chǔ)。

    PBMC主要包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,而以T細(xì)胞占多數(shù)。T細(xì)胞承擔(dān)著抗微生物、移植物排斥和腫瘤的免疫監(jiān)視等一系列重要生理功能,是細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者,在體內(nèi)通過分泌IL-2而發(fā)揮一系列重要的免疫效應(yīng)。IL-2主要由CD4、CD8 T細(xì)胞產(chǎn)生,可激活單核/巨噬細(xì)胞,并增強(qiáng)其殺瘤活性;促進(jìn)自然殺傷(NK)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性及產(chǎn)生細(xì)胞因子,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)增生;激活B細(xì)胞及產(chǎn)生抗體等。淋巴細(xì)胞因子活化殺傷細(xì)胞(IFN-γ)能促進(jìn)CTL成熟及活性;激活NK細(xì)胞殺傷活性;激活巨噬細(xì)胞并促進(jìn)其活性。研究發(fā)現(xiàn),許多中藥多糖及中藥提取物就是通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及誘生細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[3-5]。有些中藥復(fù)方也能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及提高細(xì)胞因子如IL-2的分泌[6]。實(shí)驗(yàn)中,SPS促進(jìn)PBMC的增殖,進(jìn)而增強(qiáng)其活性,有助于提高機(jī)體的細(xì)胞免疫,發(fā)揮抗腫瘤、抗感染等作用。SPS誘導(dǎo)PBMC分泌大量細(xì)胞因子,尤其是1.25 g/L和0.625 g/L劑量作用顯著。說明SPS具有明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞活化以及促進(jìn)內(nèi)源性IL-2、IFN-γ的產(chǎn)生。其結(jié)果表明這些細(xì)胞因子是SPS發(fā)揮藥效的分子介質(zhì)和物質(zhì)基礎(chǔ),是增強(qiáng)機(jī)體對(duì)各種有害因素的非特異性抵抗力的藥效機(jī)制之一。

    另外,SPS對(duì)TNF-α的分泌無明顯誘導(dǎo)作用,其原因?qū)⑦M(jìn)一步研究。

    綜上所述,紅花多糖(SPS)可促進(jìn)人PBMC增殖,提高PBMC分泌IFN-γ、IL-2,具有免疫調(diào)節(jié)作用。因此,SPS可作為免疫調(diào)節(jié)劑而用于腫瘤治療。

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    [3] 魏志文,高曉雯,鄭維發(fā).芫花根總黃酮抗腫瘤活性研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2008,24(2):116-119.

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