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    “四天穴”針?lè)綄?duì)動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠炎性因子mRNA表達(dá)的影響*

    2010-07-13 07:23:46王遵來(lái)王秀云孟向文尚秀葵
    天津中醫(yī)藥 2010年4期
    關(guān)鍵詞:夾脊椎間盤頸椎病

    周 震,王遵來(lái),王秀云,孟向文,尚秀葵

    (1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院針灸部,天津 300150;2.天津市北辰北門醫(yī)院,天津 300400;3.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193)

    頸椎病是由于頸椎間盤退變而引起的一種血管、脊髓和神經(jīng)功能障礙性疾病,其發(fā)生機(jī)制與頸椎間盤外周炎癥病理網(wǎng)絡(luò)鏈中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),即炎性因子的表達(dá)具有密切關(guān)系。本研究在前期對(duì)“四天穴”針?lè)脚R床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠頸椎間盤中炎性因子基因含量的檢測(cè),初步探索該針?lè)窖泳忣i椎病椎間盤退變的作用,為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康6月齡Wistar雄性大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2002-0003)。

    1.2 主要試劑 Tripure試劑(Boehringer Mannhein公司產(chǎn)品);SuperScript RTs試劑盒(Gibco公司產(chǎn)品);焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarbonate,DEPC,Sigma公司產(chǎn)品);脫氧核苷三磷酸(dNTP,Phermacia公司產(chǎn)品);TaqDNA聚合酶及緩沖系統(tǒng)。目的基因及內(nèi)參基因β-actin引物序列均購(gòu)自上海生工生物科技公司,序列如下:目的基因IL-1β(擴(kuò)增長(zhǎng)度245 bp)5’-CTC CATGAG CTT TGT ACAAGG-3’,5’-TGCTGA TGT ACC AGT TGG GG-3’;iNOS(擴(kuò)增長(zhǎng)度 317 bp)5’-CCA AGA ACG TGT TCA CCATG-3’,5’-GAT GTC CAG GAA GTA GGT GAG G-3’;內(nèi)參基因 β-actin(擴(kuò)增長(zhǎng)度 764 bp)5’-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3’,5’-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AG-3’。

    1.3 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組,即假手術(shù)組、模型組、四天穴針刺組、夾脊穴針刺組,每組各15只。每組再分為治療1、2、4周,共計(jì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只。

    1.4 動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型大鼠的制備 采用上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所造模方法[1],重復(fù)建立動(dòng)靜力失衡性頸椎病模型。

    1.5 治療方法 大鼠腧穴定位根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》并結(jié)合比較解剖學(xué)進(jìn)行。針刺選穴:四天穴針刺組選取雙側(cè)天鼎、天窗、天容、天牖穴。夾脊穴針刺組選取C3~C6頸夾脊穴。針刺操作時(shí),四天穴針刺組將大鼠置于麻醉罐中95%乙醚淺麻醉后固定,大鼠頸后部剪毛、消毒,所有穴位均為直刺,深度至頸椎椎體表面,施捻轉(zhuǎn)提插手法強(qiáng)刺激30 s后出針,1次/d。夾脊穴針刺組麻醉、固定、剪毛、消毒同四天穴組,所有穴位均為45度角斜刺,沿C3~C6夾脊肌外側(cè)至頸椎椎體表面,施捻轉(zhuǎn)提插手法強(qiáng)刺激30 s后出針,1次/d。

    1.6 取材及保存 大鼠急性失血法處死后,于4倍手術(shù)顯微鏡下沿上、下軟骨終板與椎體的交界面完整取下C3~C4、C5~C6椎間盤,其中C3~C4椎間盤投入4%多聚甲醛水溶液固定液瓶中,C5~C6椎間盤放入Eppendorf管,迅速投入液氮中保存。

    1.7 實(shí)驗(yàn)方法及觀察指標(biāo)

    1.7.1 形態(tài)學(xué)觀察 C3~C4椎間盤采用固定、切片、HE染色后,在100 X線學(xué)顯微鏡下對(duì)大鼠椎間盤組織形態(tài)觀察,每個(gè)標(biāo)本取連續(xù)5張切片,按Miyanmoto等[2]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將頸椎間盤分為1~5級(jí),具體分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

    表1 Miyanmoto椎間盤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Miyanmoto classification standard of cervical disc

    1.7.2 分子生物學(xué)檢測(cè) C5~C6椎間盤采用分子生物學(xué)逆轉(zhuǎn)錄-聯(lián)合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR操作流程:Trizol法提取頸椎間盤組織中總RNA;RNA變性電泳;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA);多聚酶鏈反應(yīng)(反應(yīng)條件:94℃預(yù)熱 2 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,35 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min);凝膠電泳;用密度掃描儀對(duì)特異性條帶進(jìn)行密度掃描。檢測(cè)頸椎間盤中白介素-1β(IL-1β)及 iNOSmRNA 表達(dá)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差(one-way ANOWA)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤退變程度(IDDG)比較 見(jiàn)表2。

    表2 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤退變程度(IDDG)比較(±s)Tab.2 Comparison of the degree of intervertebral disc degeneration in the intervertebral disc in each groups(±s)

    表2 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤退變程度(IDDG)比較(±s)Tab.2 Comparison of the degree of intervertebral disc degeneration in the intervertebral disc in each groups(±s)

    注:經(jīng)單因素方差分析,與假手術(shù)組同項(xiàng)目比較,★P<0.05,★★P<0.01;與模型組同項(xiàng)目比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;夾脊穴針刺組間,與1周比較,犖P<0.05;四天穴針刺組間,與 1 周比較,△P<0.05,△△P<0.01。

    組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周1.20±0.454.00±0.71★★3.20±0.45★★▲3.60±0.55★★▲治療2周1.40±0.554.20±0.45★2.80±0.84★▲▲2.60±0.89★▲▲△治療4周1.20±0.454.20±0.84★2.20±0.45★▲▲犖2.20±0.45★▲▲△△

    2.2 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤IL-1βmRNA表達(dá)結(jié)果 見(jiàn)表3。

    表3 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤IL-1βmRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s)Tab.3 comparison of the expression IL-1β mRNA in the Intervertebral disc in each groups(±s)

    表3 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤IL-1βmRNA表達(dá)結(jié)果比較(±s)Tab.3 comparison of the expression IL-1β mRNA in the Intervertebral disc in each groups(±s)

    注:經(jīng)單因素方差分析,與模型組同項(xiàng)目比較,★★P<0.01;與四天穴位針刺組同項(xiàng)目比較,△P<0.05;夾脊穴針刺組間,與1周比較,☆P<0.05;與 2 周比較,▲P<0.01;四天穴針刺組間,與 1周比較,犖P<0.05;與 2 周比較,▲P<0.05。

    組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周1.202±0.0271.222±0.1330.816±0.067★★△0.750±0.140★★治療2周0.177±0.0381.084±0.6170.685±0.144★★△☆0.502±0.192★★犖治療4周1.20±0.454.20±0.84★2.20±0.45★▲▲犖2.20±0.45★▲▲△△

    2.3 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤iNos mRNA表達(dá)結(jié)果 見(jiàn)表4。

    表4 各實(shí)驗(yàn)組頸椎間盤iNos mRNA表達(dá)結(jié)果(±s)Tab.4 Comparison of the expression iNOS mRNA in the intervertebral disc in each groups(±s)

    注:經(jīng)單因素方差分析,與模型組比較,★★P<0.01;夾脊穴針刺組間,與1周比較,☆P<0.01;與2周比較,茛P<0.05;四天穴針刺組間,與1 周比較,犖P<0.05;與 2 周比較,▲P<0.05。

    組別假手術(shù)組模型組夾脊穴針刺組四天穴針刺組n5555治療1周0.100±0.0291.136±0.1090.780±0.099★★0.633±0.110★★治療2周0.073±0.0251.014±0.1750.474±0.116★★☆0.504±0.119★★犖治療4周0.051±0.0220.911±0.1650.339±0.077★★☆茛0.347±0.114★★犖▲

    3 討論

    越來(lái)越多的證據(jù)表明,在椎間盤退變—炎癥反應(yīng)—根性痛網(wǎng)絡(luò)鏈中,炎癥損傷起了更為主要的作用。一些生化介質(zhì)參與了這種改變,其中尤以IL-1的作用引人注目。IL-1β是一種重要的前炎性細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá),并介導(dǎo)了中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的聚集和浸潤(rùn)。其作為椎間盤退變過(guò)程的潛在始動(dòng)因素,對(duì)其退變過(guò)程的影響是多環(huán)節(jié)的,既可通過(guò)誘導(dǎo)金屬蛋白酶(MMPs)和一氧化氮(NO)促進(jìn)髓核中蛋白聚糖(PG)的分解及抑制PG合成,導(dǎo)致PG的凈丟失而影響退變本身,也可通過(guò)其他炎性介質(zhì)影響其繼發(fā)性病理過(guò)程[3]。

    此外,突出的椎間盤還可自發(fā)分泌NO,IL-1可刺激其進(jìn)一步分泌。NO除抑制PG合成外,還是一種新的炎癥介質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì),不但具有極強(qiáng)的擴(kuò)張血管和增加血管通透性的作用。而且在炎癥反應(yīng)中也起重要作用,同時(shí)能增強(qiáng)傷害性感受器的敏感性,參與椎間盤退變所導(dǎo)致的神經(jīng)根痛病理過(guò)程。

    “四天穴”針?lè)綖閷?dǎo)師劉公望教授長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié),主要包括天鼎、天窗、天容、天牖四穴,均位于頸項(xiàng)部,分別屬手陽(yáng)明、手太陽(yáng)、手少陽(yáng)經(jīng)穴。正如“經(jīng)脈所過(guò),主治所及”,四穴合用可激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣,使氣至病所,疏經(jīng)活血通絡(luò)而達(dá)治療目的。該針?lè)浇?jīng)10余年長(zhǎng)期大量臨床觀察,證明其療效確切,可有效改善患者的臨床癥狀,且預(yù)后良好[4-7]。

    本研究通過(guò)Miyanmoto椎間盤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)“四天穴”針?lè)綄?duì)頸椎間盤組織形態(tài)學(xué)的影響,結(jié)果顯示,模型組、“四天穴”針刺組及夾脊穴針刺組3組均有不同程度退變的表現(xiàn),模型組退變程度最重,其余針刺兩組退變程度較輕,其中“四天穴”針刺組退變程度最輕。初步判定,“四天穴”針?lè)侥苡行Ц纳祁i椎間盤退變的形態(tài)學(xué)改變。

    同時(shí),采用分子生物學(xué)RT-PCR法觀察該針?lè)▽?duì)椎間盤中IL-1βmRNA及iNOSmRNA表達(dá)的影響。吸光度掃描(IOD)分析,與模型組比較,四天穴針刺組及夾脊穴針刺組對(duì)頸椎間盤中炎癥因子IL-1β及iNOS基因表達(dá)都有一定程度的抑制作用,且在4周時(shí)IOD數(shù)值均值最小,統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0.05);兩針刺組間比較有顯著性差異(P<0.05);表明四天穴針刺組要明顯優(yōu)于夾脊穴針刺組;四天穴針刺組間比較,在1、2及4周3個(gè)時(shí)間相中,2周組、4周組均顯著低于1周組,4周組也顯著低于2周組。結(jié)果表明,針刺“四天穴”針?lè)侥芙档湍P痛笫箢i椎間盤內(nèi)炎性因子IL-1βmRNA、iNOSmRNA的表達(dá),具有抑制外周炎性因子的作用。且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),“四天穴”針?lè)ǖ闹委熜Ч絹?lái)越明顯,這也與在前期臨床觀察中及上述實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果是一致的。

    [1] 王擁軍,施 祀,沈培芝,等.動(dòng)靜力失衡性大鼠椎間盤退變模型的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2001,21(3):199-200.

    [2] Miyanmoto S,Yoneenobu K,Keiro O.Experimental cervical spondylosis in the mouse[J].Spine,1991,15(510):495-500.

    [3] 姜 杰.IL-1與椎間盤退行性病變[J].頸腰痛雜志,2000,10(4):339-340.

    [4] 王秀云,劉公望.針刺四天穴方治療神經(jīng)根型和椎動(dòng)脈型頸椎病療效觀察[J].針灸臨床雜志,2003,19(2):41-44.

    [5] 尚秀葵,胡明海,孟 紅.針刺“四天”穴為主治療頸肩綜合癥[J].中國(guó)針灸,1998,4:284-286.

    [6] 尚秀葵,孟向文.針刺“四天”穴為主治療神經(jīng)根型頸椎病臨床觀察[J].中國(guó)針灸,2002,22(11):732-734.

    [7] 董洪英,劉公望.針“四天”穴為主治療頸源性眩暈的臨床療效觀察[J].針灸臨床雜志,2005,21(7):41-42.

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