高熱對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血灶5-LO表達(dá)的影響

胡成伍 夏加琴 吳家冪

1)湖北潛江市中心醫(yī)院 潛江 433100 2)安徽蕪湖市第一人民醫(yī)院 蕪湖 241000 3)皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院 蕪湖241001

關(guān)于腦缺血再灌流期間高熱對腦缺血損傷的作用,迄今國內(nèi)外研究結(jié)果不一致[1-2]。本工作在大鼠局部腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)給予短暫高熱,探討高熱對缺血性腦損傷的作用,為臨床對急性腦卒中患者的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組健康雄性Sprague-Dawley大鼠66只,鼠齡3～4個(gè)月,體質(zhì)量 275～325 g,由南京青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分為3組:假手術(shù)(Sham)組(n=6),缺血再灌注后正常體溫組(normathermia,NT)組(n=30),缺血再灌注組后高熱(hyperthermia,HT)組(n=30)。CIR后NT組和HT組分別按12 h后、24 h后、48 h后、72 h后、120 h后再各分5個(gè)亞組(n=6)。假手術(shù)組再分為NT和HT)2個(gè)亞組(n=3)。

1.2大鼠局部腦缺血再灌流模型的制備參照Zea Lon-ga[3]方法制備大鼠腦缺血再灌流模型,腦缺血2 h后將尼龍絲線拔出,退至頸外動(dòng)脈內(nèi)恢復(fù)再灌流,假手術(shù)組插尼龍線深度為小于10 mm。扎緊備線,外留10 mm長線頭,縫合皮膚。手術(shù)全過程應(yīng)用100W 燈泡照明,調(diào)節(jié)燈泡至大鼠的距離,以保持大鼠肛溫為(37.0±0.5)℃。插入栓線2h后,回抽栓線使其頭端回到頸外動(dòng)脈內(nèi),恢復(fù)頸內(nèi)動(dòng)脈血流,實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.3大鼠體溫調(diào)控參照L.A.Favero-Filho等[4]的實(shí)驗(yàn)方法使用100 W白熾燈及恒溫控制器升高大鼠肛溫。期間大鼠自由飲水。加溫干預(yù)時(shí)間分別為 CIR11 h、23 h、47 h、71 h、119 h后。加溫時(shí)間為1 h。大鼠 CIR模型成功后,每隔12 h測量體溫,升高體溫干預(yù)開始后每隔15 min測量大鼠肛溫。保持大鼠肛溫39.0～39.5℃。如果大鼠在加溫前和常溫組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)前出現(xiàn)體溫異常(＜37.0℃或＞38.0℃)則被剔除。

1.4神經(jīng)功能缺損評(píng)分及模型成功標(biāo)準(zhǔn)模型成功的標(biāo)準(zhǔn)以Zea Longa 5分法[3]為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分,無神經(jīng)缺損癥狀;1分,提尾時(shí)癱側(cè)前肢內(nèi)收,不能完全伸直;2分,行走時(shí)向癱側(cè)傾倒;3分,行走時(shí)向癱側(cè)旋轉(zhuǎn);4分,不能行走或昏迷。評(píng)分為1～3分者為成功模型。未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者視為模型制作失敗,不計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。因麻醉未清醒者以及清醒后死亡經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)存在蛛網(wǎng)膜下腔出血的也視為模型制作失敗不計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。

1.5腦梗死體積測定及免疫組化染色取大鼠腦組織后,從視交叉前緣始向后作2 mm厚冠狀位腦組織塊,將除紋狀體平面外的腦組織置于2%TTC染色,再用4%多聚甲醛固定3～5 h后的腦組織數(shù)碼相機(jī)(微距,且用三角架固定焦距)拍取照片,然后采用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件計(jì)算大鼠腦梗死體積。紋狀體平面的腦組織的梗死體積的取其相鄰兩個(gè)腦片梗死體積之和的平均值[5]。將紋狀體平面腦組織切片制成蠟塊。腦組織蠟塊標(biāo)本進(jìn)行5 μ m厚的連續(xù)切片。每間隔5片選1片行常規(guī)HE染色,光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變。剩余切片用兔抗鼠多克隆抗體ALOX5ABC(武漢博士德公司提供)免疫組化染色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行資料處理,2組均數(shù)間比較t檢驗(yàn),方差不齊時(shí),用Tamhane's T2檢驗(yàn)。雙變量關(guān)系采用直線相關(guān)分析,非正態(tài)資料使用Mann-Whitney U檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分CIR后NT組和CIR后HT組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分與假手術(shù)組相比明顯增加,比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CIR后N T組大鼠清醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀,12 h后癥狀進(jìn)展,24 h后繼續(xù)發(fā)展、48 h后最嚴(yán)重,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CIR NT組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分自72 h后即下降。CIR HT組12 h、24 h、48 h的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較CIR NT組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CIR HT組72h、120h的神經(jīng)功能缺損評(píng)分較 CIR NT組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

2.2腦缺血再灌注后高熱對梗死體積和梗死灶周邊皮質(zhì)5-LO表達(dá)的影響CIR后NT組和CIR后HT組梗死體積與假手術(shù)組相比明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CIRNT組72 h后梗死體積逐漸減少,120 h后梗死體積最小。雖然CIR NT組72 h、120 h梗死體積較 HT組 72 h、120 h增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。假手術(shù)HT組和NT組紋狀平面腦組織有少量5-LO表達(dá),主要位于神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi),為棕黃色顆粒,細(xì)胞形態(tài)正常。CIR NT組和HT組12 h、24 h、48 h后梗死中心,都有少量 5-LO陽性神經(jīng)元細(xì)胞存在,半暗帶皮質(zhì)可見5-LO陽性神經(jīng)元細(xì)胞明顯增多,胞漿及胞膜均有5-LO表達(dá),但以胞漿明顯。

表2 5-LO表達(dá)與梗死體積 (mm3,s)

表2 5-LO表達(dá)與梗死體積 (mm3,s)

注:HT與 NT比較,*P＞0.05,兩兩比較,△P＜0.05;HT、NT分別與假手術(shù)組比較,◆P＜0.05;r=0.649,P＜0.05

n 高熱組(HT)常溫組(NT)5-LO 梗死體積(mm3)5-LO 梗死體積(mm3)假手術(shù)組 3 0.83±0.07 0.00±0.00 0.81±0.05* 0.00±0.00*CIR12 h 6 12.03±2.04△◆ 134.27±15.60△◆ 6.33±1.37◆ 72.33±16.60◆CIR24 h 6 18.00±2.03△◆ 174.48±18.20△◆ 11.17±1.47◆ 97.90±3.88◆CIR48 h 6 16.33±1.75△◆ 178.33±10.16△◆ 11.33±1.75◆ 119.83±17.77◆CIR72 h 6 6.03±1.17*◆ 90.75±17.44*◆ 7.83±1.72◆ 93.23±18.43◆CIR120 h 6 5.66±2.52*◆ 57.18±18.33*◆ 5.83±2.32◆ 70.43±13.48◆

CIR HT組和NT組分別與假手術(shù)組相比腦組織5-LO陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CIR HT組12 h、24 h、48 h后半暗帶皮質(zhì)5-LO陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)較CIR NT組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)增加顯著(P＜0.05)。CIR HT組72 h、120 h后半暗帶皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞雖然仍有5-LO表達(dá),但較CIR NT組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)增加不明顯(P＞0.05)。CIR后缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO與梗死體積存在正相關(guān)(r=0.649,P＜0.05)見表2。

3 討論

腦血管疾病是目前危害人類健康的三大疾病之一。其中缺血性腦血管疾病以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率而嚴(yán)重危害人們的身體健康。臨床中常發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中后患者體溫升高,體溫升高的原因主要為感染,其次為缺血性腦卒中影響下丘腦體溫中樞而引起體溫升高[6]。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIR HT組神經(jīng)功能缺損評(píng)分12 h、24 h、48 h后組比NT組相對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)增加;CIR HT組72 h、120 h后較NT組神經(jīng)缺損評(píng)分雖有增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因?yàn)樯窠?jīng)功能缺損與損傷范圍并非總是相關(guān)[7],因此本實(shí)驗(yàn)又采用另一更加直接的指標(biāo)—腦梗死體積來觀察大鼠CIR后高熱對腦組織的影響。HT組和NT組12 h后見明顯梗死病灶,24 h后體積逐漸增大,48 h后梗死體積達(dá)到高峰。72 h后梗死體積逐漸減少,120 h后梗死體積最小。HT組12 h、24 h、48 h梗死體積較NT組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯增加,通過HT組與NT組之間梗死體積的比較更加說明缺血性腦卒中48 h內(nèi)高熱可加重腦損傷。其原因可能由于短暫腦缺血再灌流早期腦缺血細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能尚未完全恢復(fù),此時(shí)再灌流損傷及高溫的共同作用使許多可逆的腦缺血細(xì)胞進(jìn)入不可逆狀態(tài),增加腦梗死體積,在再灌流晚期,再灌流損傷作用的減弱或消失,缺血半暗帶中可逆狀態(tài)的缺血腦細(xì)胞基本恢復(fù)了正常功能,可通過自身保護(hù)機(jī)制抵御高熱造成的損傷,因此隨再灌流時(shí)間的延長,高熱對腦缺血損傷的作用趨于不明顯。高熱對大鼠CIR后加重腦損傷的機(jī)制可能有:①高熱能通過辣椒素受體3(Transient receptor potential vanilloid 3,TPRV3)引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載,加重神經(jīng)損傷。Xu H等[8]報(bào)道當(dāng)溫度從22℃升高到40℃,TRPV3可被激活,并在一定范圍內(nèi)隨溫度升高電流增大。已有研究表明高熱刺激通過TRPV3受體引起鈣內(nèi)流[9]。②腦卒中后的高熱可促進(jìn)氨基酸遞質(zhì)的釋放。③腦卒中后的高熱可使氧自由基增多,可加重血腦屏障的損害[10]。

雖然高熱可能通過以上機(jī)制加重腦損傷,但是其具體機(jī)制仍不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)5-LO與腦缺血再灌注損傷有密切關(guān)系。Manu Jatana等[11]研究使用5-LO抑制劑BW-B 70 C和AA-861作為干預(yù)后發(fā)現(xiàn)5-LO抑制劑干預(yù)組大鼠局灶性腦缺血再灌注24 h后梗死體積較對照組縮小、神經(jīng)功能缺損評(píng)分改善。該研究雖然說明5-LO可以加重腦缺血再灌注損傷,但一直以來,CIR后高熱與5-LO之間的關(guān)系研究較少。本實(shí)驗(yàn)中假手術(shù)HT組腦組織神經(jīng)元5-LO表達(dá)很少,與假手術(shù)NT組相比沒有增加,說明短暫高熱對正常腦組織的影響較小。而且HT組12 h、24 h、48 h時(shí)缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達(dá)比NT組明顯增加;CIR72 h后NT組比HT組缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達(dá)雖有增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明高熱能使CIR48 h內(nèi)缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達(dá)增加,同時(shí)提示大鼠CIR后缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達(dá)能夠加重腦損傷,而且5-LO表達(dá)越多,梗死體積越大,二者之間存在正相關(guān)。解釋這一結(jié)果的可能原因?yàn)殡S著再灌注時(shí)間延長,CIR后缺血半暗帶逐漸減少,這樣CIR48 h后缺血灶周邊神經(jīng)元對高熱等傷害性刺激無反應(yīng),5-LO表達(dá)減少,所以高熱對大鼠CIR后加重腦損傷的時(shí)間窗為CIR后48 h內(nèi)。高熱使缺血灶周邊神經(jīng)元5-LO表達(dá)雖有增加的機(jī)制可能為①高熱能通過TPRV3受體引起細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)流,而鈣離子能夠誘導(dǎo)5-LO膜聚集。而細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載可以能夠誘導(dǎo)5-LO膜聚集。②高熱能促進(jìn)蛋白激酶及其磷酸化活化[12]。P38蛋白激酶被磷酸化活化,并通過磷酸化活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特定基因的表達(dá),繼而可在細(xì)胞內(nèi)鈣參入下激活5-LO。

雖然高熱可能通過上述途徑促進(jìn)缺血性腦卒中后5-LO表達(dá)進(jìn)而加重腦損傷,但是否存在其他途徑有待進(jìn)一步研究。盡管如此,臨床上缺血性腦卒中如果患者出現(xiàn)高熱(48h內(nèi)),都應(yīng)該給予積極的干預(yù)以減少患者腦損傷。

[1]Reith JJ,rgensen HS,Pedersen PM,et al.Body temperature in acute stroke:relation to stroke severity,infarct size,mortality,and outcome[J].Lancet,1996,347:422-425.

[2]Leira R,Rodr íguez-Yáez M,Castellanos M.Hyperthermia is a surrogate marker of inflammation-mediated cause of brain damage in acute ischaemic stroke[J].Journal of Internal Medicine,2006,260:343-349.

[3]Zea Longa,Weinstein PR,Carlsons et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84-91.

[4]Favero-Filho1 LA,Borges AA,Grassl C,et al.Hyperthermia induced after recirculation triggers chronic neurodegeneration in the penumbra zone of-focal ischemia in the rat brain[J].Brazilian Journal of Medical and Biological Research,2008,41:1 029-1 036.

[5]梁澤華,魏爾清,朱朝陽,等.圖像分析定量測量腦片體積方法的改良[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2003,32:697.

[6]Fuhai Li,Tsuy oshi Omae,Marc Fisher.Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion mode of rats[J].Stroke,1999,30:2 464-2 467.

[7]李捷,張蓬勃,劉勇.對大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)功能障礙判斷方法的改進(jìn)[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24:1 970-1 972.

[8]Xu H,Ramsey IS,Kotecha SA,et al.T RPV3 is a calcium-permeable temperature sensitive cation channel[J].Nature,2002,418:181-186.

[9]Smith GD,Gunthorpe M J,Kelsell RE,et al.T RPV3 is a tem-perature-sensitive vanilloid receptor-like protein[J].Nature,2002,418:186-190.

[10]Eugene A Kiyatkin,Brown P Leon,Hari S Sharma.Brain edema and breakdown of the blood–brain barrier during methamphetamine intoxication:critical role of brain hyperthermia[J].European Journal of Neuroscience,2007,26:1242-1253.

[11]Manu Jatana,Shailendra Giri,Mubeen A Ansari,et al.Inhibition of NF-κ B activate-on by 5-lipoxygenase inhibitors protects brain against injury in a rat model of focal cerebral ischemia[J].Journal of Neuroinflammation,2006,3:1-12.

[12]Fukunaga K,Miyamoto E.Role of M AP kinase in neurons[J].M ol Neurobiol,1998,16:79-95.