血小板膜糖蛋白Ⅰbα VNTR基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

李湘青 翟鳳英

山東淄博市中心醫(yī)院 1)神經(jīng)內(nèi)科 2)高壓氧科 淄博 255006

血小板在缺血性腦血管病的發(fā)展中起重要作用[1]。血小板膜糖蛋白(GP)是一種存在于血小板質(zhì)膜表面的糖蛋白,在血小板活化和血栓形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用。GPⅠbα復(fù)合物受體是切變應(yīng)力依賴性受體[2-3],在動(dòng)脈系統(tǒng)中,整體血流切變應(yīng)力較高,尤其在粥樣硬化斑塊或血管痙攣所致的狹窄動(dòng)脈中,血流切變應(yīng)力可成倍地增加,高切變應(yīng)力使GPIbα復(fù)合物與vWF結(jié)合始動(dòng)血小板的聚集、活化。繼而改變GPⅡb/Ⅲα受體結(jié)構(gòu),使其激活,形成血小板血栓。因此,GPⅠbα復(fù)合物在高切變應(yīng)力條件下血小板血栓形成和動(dòng)脈硬化進(jìn)展中起重要作用[4],本研究為可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeat,VNTR)多態(tài)性[5],即編碼其巨糖肽區(qū)域的DNA序列中有39個(gè)堿基在不同的等位基因重復(fù)的數(shù)目不同,產(chǎn)生 A、B、C、D四種等位基因。多態(tài)重復(fù)序列可以使GPⅠbα復(fù)合物與vWF結(jié)合位點(diǎn)延伸,影響GPⅠb復(fù)合物與vWF的親和力,進(jìn)而影響血栓性疾病的易患性[6]。逐漸增加的證據(jù)[7-8]表明某些基因因素能影響止血平衡和血栓形成的危險(xiǎn)性。本研究的目的是探討GPⅠb基因α鏈VNT R與腦梗死的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象本文共收集105例腦梗死患者,同時(shí)收集100例年齡與性別相匹配的正常人或其他疾病住院的患者作為對(duì)照。病例組均行頭顱M RI和(或)CT掃描明確診斷,符合1996年第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn),并排除腦出血和占位性病變。對(duì)照組均無(wú)缺血性腦血管病或冠心病史。各組年齡均＞45歲,排除青年性卒中。所有研究對(duì)象均行血糖、血脂等檢查。高血壓病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為Bp≥140/90 mmHg或正服用降壓藥物;糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖≥7.0 mmol/L或服用降糖藥物;吸煙的標(biāo)準(zhǔn)為正在吸煙或有吸煙史;高血脂的標(biāo)準(zhǔn)為血中膽固醇≥5.62 mmol/L或(和)甘油三脂≥1.92 mmol/L或服用降血脂藥物。

1.2方法

1.2.1 提取基因組DNA:靜脈抽取空腹血 1 mL,加20 μ L EDTA抗凝,4℃冰箱短期存放。采用北京百盛公司生產(chǎn)的UltraPureTM基因組DNA提純?cè)噭┖?提取的基因組DNA置于-20℃保存。

1.2.2 血小板GpⅠα基因VNTR多態(tài)性分析:引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成:正義鏈5-CAC TAC TGA ACC AAC CCC AAG-3,反義鏈5-TTG TGG CAG ACA CCA GGA TGG-3,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體積:25 μ L,含模板 DNA2 μ L,dNTPs(200 mM)0.5 μ L,引物各 0.3 μ M,MgCl 1.5 mM,10×Buffer 2.5 μ L,Taq聚合酶1.5 U。 Taq酶和dNTP由華美生物工程公司生產(chǎn)。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃4 min;95℃變性45 s,60℃退火1 min,72℃延伸 1 min,擴(kuò)增 38個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸8 min。吸取 PCR產(chǎn)物10 μ L,在封口膜上和上樣緩沖液2 μ l充分混勻,0.1%溴化乙錠染色,依次加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中;吸取 DNAMarker 12 μ L(華美生物工程公司的Pgem-7Zf(+)HaeⅢMarker)加入一側(cè)的加樣孔中,在1×TBE緩沖液中電泳40 min,電壓80 V。放入紫外分析裝置中,檢測(cè)PCR產(chǎn)物的片段大小。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。年齡比較用t檢驗(yàn),性別、高血壓、糖尿病、高血脂以及吸煙比較用χ2檢驗(yàn)?；蛐秃偷任换蝾l率的差異用χ2檢驗(yàn)或有關(guān)校正方法,P＜0.05者計(jì)算相應(yīng)的OR值和95%CI。按Hardy-Weinberg平衡法檢驗(yàn)樣本的群體代表性。用Logistic多元回歸分析來(lái)控制其他混淆變量的影響。

2 結(jié)果

2.1腦梗死組和對(duì)照組的臨床特征比較105例腦梗死患者和100例對(duì)照之間年齡、性別構(gòu)成沒(méi)有差別。腦梗死組高血壓、糖尿病、高血脂或吸煙的百分比均顯著高于對(duì)照組(表1),與目前公認(rèn)的結(jié)論一致,這些情況都是腦梗死的危險(xiǎn)因素。

表1 腦梗死組和對(duì)照組的臨床特征比較

2.2血小板GpIbα VNTR多態(tài)性電泳結(jié)果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳出現(xiàn)3種DNA片段,195 bp的一個(gè)重復(fù)片段,234 bp的2次重復(fù)片段和273 bp的3次重復(fù)片段,312 bp的4次重復(fù)序列片段在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn),僅有195 bp帶型的為DD純合子基因型,僅有234 bp帶型的為CC純合子基因型。同時(shí)發(fā)現(xiàn)有195 bp和234 bp帶型的DC基因型、195 bp和273 bp帶型的DB基因型、234 bp和273 bp帶型的BC三種雜合基因型(圖1)。

圖1 GPIbα VNTR多態(tài)性電泳結(jié)果

2.3 GPIbα VNTR多態(tài)性的分布情況多態(tài)性各種基因型和等位基因的頻率分布見(jiàn)表 2。DD、CC、CD、BD、BC基因型的頻率在腦梗死組分別為 0.15、0.38、0.35、0.048、0.067,在對(duì)照組分別為 0.04、0.57、0.37、0.01、0.01。B、C、D 等位基因的頻率在腦梗死組分別為 0.057、0.59、0.35,在對(duì)照組分別為0.01、0.76、0.225。腦梗死組與對(duì)照組經(jīng) Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)為遺傳平衡群體(P＞0.05)。BC、CC、DD基因型2組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。計(jì)算BC基因型的比數(shù)比OR=7.071,表明BC基因型是缺血性腦血管病的可能致病危險(xiǎn)因素,95%CI(0.85～58.55)(見(jiàn)表2)。通過(guò)基因型分布計(jì)算B、C、D等位基因頻率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P=0.001。計(jì)算比數(shù)比OR=3.98,說(shuō)明B等位基因具有致病危險(xiǎn)性(見(jiàn)表3)。我們對(duì)105例腦梗死病人及100例對(duì)照人群進(jìn)行GPIbα VNTR多態(tài)性基因檢測(cè),未發(fā)現(xiàn) A、B等位基因純合子及AB、AC、AD雜合子基因型,與德國(guó)白人、美國(guó)白人不同,即A等位基因表達(dá)低,C、D等位基因表達(dá)高。

表2 腦梗死組和對(duì)照組各基因型分布比較

表3 缺血性腦血管病組和對(duì)照組等位基因頻率

2.4危險(xiǎn)因素獨(dú)立性分析由于高血壓、糖尿病及吸煙等因素在腦梗死組和對(duì)照組之間均有顯著性差別,為了排除這些因素對(duì)基因型的影響,以缺血性腦血管病為因變量,以高血壓、高脂血癥、糖尿病、GPⅠb B(+)等位基因?yàn)樽宰兞?作Logistic回歸分析,結(jié)果顯示B(+)等位基因是缺血性腦血管病發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素,OR=5.104,P=0.046,95%CI為0.96～27.147。

3 討論

血小板是構(gòu)成動(dòng)脈血栓的重要成分之一,血小板的粘附、聚集功能是通過(guò)血小板膜糖蛋白(GP)來(lái)完成的。GPIbα胞外區(qū)球狀N-末端含有vWF和凝血酶結(jié)合位點(diǎn)以及粘蛋白樣區(qū)稱為巨球肽,第一個(gè)被確定的多態(tài)性為編碼巨球肽區(qū)域的39 bpVNTR,在人群中存在四種等位基因,按分子量由小到大被命名為D、C、B、A,每個(gè)重復(fù)序列導(dǎo)致蛋白增加 13個(gè)氨基酸,使得vWF結(jié)合區(qū)遠(yuǎn)離血小板膜,這種結(jié)構(gòu)的變化將分子暴露于更大的剪切力,導(dǎo)致剪切力誘導(dǎo)的vWF和GPⅠbα相互作用的閾值降低。血小板黏附增強(qiáng),活化程度異常增高,則可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程,并始動(dòng)病理性的血栓形成,參與動(dòng)脈血栓性疾病的發(fā)生和發(fā)展,給機(jī)體造成嚴(yán)重的危害[9]。在粥樣硬化斑塊阻塞或血管痙攣造成的狹窄動(dòng)脈中,血流切變應(yīng)力成倍地增加,高切變應(yīng)力可誘導(dǎo)vWF的構(gòu)型發(fā)生改變,多聚體形式的vWF與多個(gè)GPIb分子以多價(jià)方式形成牢固的結(jié)合,vWF與GPⅠb間的相互作用不僅導(dǎo)致血小板與內(nèi)皮組織發(fā)生接觸黏附,當(dāng)vWF與GPⅠb復(fù)合物結(jié)合后,使血小板活化,啟動(dòng)血小板跨膜鈣內(nèi)流,GPⅡb/Ⅲa受體部位暴露,構(gòu)象改變,介導(dǎo)血小板黏附聚集,最終導(dǎo)致血小板血栓形成。因此,GPⅠb復(fù)合物在高切變應(yīng)力下血小板血栓形成和動(dòng)脈硬化進(jìn)展中起重要作用,其分子數(shù)增高為血小板黏附性增高的重要原因,促成血栓前狀態(tài)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明[10],血小板與血管壁相互作用受阻可減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,GPⅠb阻滯劑可阻止或延緩冠狀動(dòng)脈閉塞的發(fā)生。因此研究探討GPⅠbα基因多態(tài)性與缺血性腦血管病的相關(guān)性,將為缺血性腦血管病的早期檢測(cè)和防治提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

諸多資料表明[11-12]不同地區(qū)、不同種族的人群中,VNTR多態(tài)性的基因型分布有差別。高加索人CC最多,占64.75%,日本人 CD最多,占40.46%,白種人中 A等位基因很少表達(dá),B等位基因頻率較高,A等位基因在日本人常見(jiàn),兩者均以C等位基因頻率最高。本研究結(jié)果顯示本地區(qū)人群A等位基因無(wú)表達(dá),而C、D等位基因表達(dá)較高,分別為67.54%、27.4%?；蛐头植家?CC最多,占 53.17%,CD基因型次之,占35.6%,與我國(guó)學(xué)者[13]研究結(jié)果相似。此結(jié)果還有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

越來(lái)越多的研究表明GPⅠbα VNTR基因多態(tài)性與血栓性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14]。目前研究較多的是其與冠心病的相關(guān)性[15]。Baker[16-17]等發(fā)現(xiàn) GPⅠb αVNT R B等位基因與急性缺血性腦血管病有關(guān),最近西班牙學(xué)者[18]研究了阿司匹林治療失敗(A TF)的再發(fā)卒中的基因因素,結(jié)論是BC基因型是預(yù)測(cè)卒中后阿司匹林治療再發(fā)卒中的獨(dú)立因素。而有些研究[19]發(fā)現(xiàn)缺血性中風(fēng)與GPⅠb αVNTR等位基因無(wú)相關(guān)性。這些不一致的結(jié)果可能與缺乏較好的臨床研究標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),缺血性腦血管病組BC基因型的分布頻率為 6.7%,較對(duì)照組明顯增高(1%),χ2=4.386,P=0.036。B等位基因頻率在缺血性腦血管病組也明顯偏高為5.7%,對(duì)照組為1%,χ2=5.162,P=0.023。統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均有顯著性。通過(guò)對(duì)各種危險(xiǎn)因素的統(tǒng)計(jì)分析(χ2檢驗(yàn))發(fā)現(xiàn)高血壓、糖尿病、高脂血癥及B等位基因2組間比較均有顯著性差異(P值0.05),應(yīng)用Logistic回歸分析,說(shuō)明高血壓、吸煙、B等位基因可能是腦梗死的發(fā)病危險(xiǎn)因素。因此,人群中GPⅠbαVNTR多態(tài)性與缺血性腦血管病有相關(guān)性。B等位基因和BC基因型可能是腦梗死的致病危險(xiǎn)因素。目前仍需要大量的前瞻性的基因及流行病學(xué)研究闡明GPⅠbα每個(gè)基因多態(tài)性的作用及其他血小板受體多態(tài)性的作用以及這些因素聯(lián)合作用的協(xié)同效應(yīng)。

缺血性腦血管病是一多因素疾病,大多數(shù)為遺傳與環(huán)境因素聯(lián)合所致,危險(xiǎn)基因的探尋有助于早期發(fā)現(xiàn)易患人群,進(jìn)行重點(diǎn)防治。目前抗血小板治療在治療和預(yù)防中風(fēng)中廣泛應(yīng)用,如阿司匹林、噻氯匹啶等,但療效不甚滿意。隨著血小板膜糖蛋白分子生物學(xué)研究的深入及血栓形成分子機(jī)制的闡明,新的血小板膜受體拮抗劑的合成將會(huì)取代或補(bǔ)充阿司匹林的作用。現(xiàn)已合成的GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑有TP9201、MK383、integrelin、阿昔單抗等,大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)也對(duì)GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑的療效給予了充分肯定[20],阿司匹林抑制環(huán)氧化酶,能一定程度上阻止血小板的聚集和釋放反應(yīng),但不能阻斷高切變應(yīng)力誘導(dǎo)的血小板聚集,噻氯匹啶和GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑均能較好地阻斷血小板的聚集,特別是GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑阻斷血小板聚集的共同通路,能有效地抑制高切變應(yīng)力誘導(dǎo)的血小板聚集,但不能有效地抑制血小板釋放反應(yīng),通過(guò)GPⅠb研究,針對(duì)GPⅠb復(fù)合物及vWF的抗血小板藥物的研制,可望受到良好的臨床療效。

通過(guò)本研究,我們對(duì)本地區(qū)人群GPⅠbα(VNTR)基因多態(tài)性分布特點(diǎn)及其與缺血性腦血管病相關(guān)性作出了初步的探索,獲得了初步的結(jié)論,但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本,嘗試多種實(shí)驗(yàn)方法,以獲得更確切的結(jié)論。

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