大豆皂甙含量的QTL分析

田 俊，宋雯雯，韓 雪，高慕娟，楊繼學(xué)，王繼安

（大豆生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆皂甙（Soyasaponin）是大豆中存在的一類具有較強(qiáng)生物活性的物質(zhì)，具有較多對(duì)人體有益的生理功能，被廣泛的應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥等方面。但由于大豆皂甙的溶血作用以及對(duì)人體粘膜有強(qiáng)烈的刺激作用，也被認(rèn)為是造成大豆制品帶苦澀味的來源，所以在大豆制品中人們都盡量將其除去，但是隨著對(duì)大豆皂甙的多種有利的生理功能的發(fā)現(xiàn)和重新評(píng)價(jià)，對(duì)它的研究逐漸走向熱門。國內(nèi)外已有很多大豆深加工企業(yè)建立生產(chǎn)線從大豆籽粒中連續(xù)提取皂甙和其他大豆生物活性物質(zhì)，這使得市場上對(duì)優(yōu)質(zhì)特種大豆的原料需求增加。然而，目前對(duì)于大豆皂甙的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功效、機(jī)理等方面的研究報(bào)道較多，而對(duì)于大豆皂甙專用品種的選育方面的研究較少[1-4]。

本研究分析了大豆雜交后代皂甙含量的遺傳變異規(guī)律，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，研究與皂甙含量相關(guān)的QTLs，為利用分子輔助手段培育高皂甙含量大豆品種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用大豆皂甙含量高的親本哈91016（♀）和大豆皂甙含量低的親本N98-9445A（♂）及二者雜交所得的F2群體中隨機(jī)抽取的198個(gè)樣本材料。親本于2008年種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地。

1.2 方法

1.2.1 大豆皂甙含量測定

本試驗(yàn)采用大豆皂甙的甙元類似物齊墩果酸作為標(biāo)準(zhǔn)品的比色法測定大豆皂甙的含量[5]。最佳測定條件：粉碎樣品過60目篩，有機(jī)溶劑脫脂后加入70%乙醇水溶液，70℃水浴加熱浸提3.5 h、過濾重復(fù)1次，取濾液于40℃旋轉(zhuǎn)揮發(fā)回收乙醇得皂甙粗提液，再用飽和正丁醇萃取過夜，分離正丁醇相，減壓濃縮呈褐色粘稠狀，加甲醇溶解定容至10 mL，吸取樣品50 μL進(jìn)行上述香草醛-高氯酸顯色反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)測定最大吸收值[5]。

1.2.2 葉片總DNA的提取

采用改進(jìn)的CTAB法提取葉片總DNA[6]。

1.2.3 SSR反應(yīng)

SSR引物來源：根據(jù)SoyBase提供的SSR引物序列，由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)液包括2 μL模板DNA（25 ng·μL-1），12.5 μL PCR水，2 μL Buffer，1.5 μL SSR引物（10 mg·μL-1），1.5 μL dNTP（10 mmol·L-1），0.5 μL Taq酶（5 U·μL-1），液體石蠟覆蓋。

PCR擴(kuò)增條件：反應(yīng)在PTC-100TMPeltiter thermal cycle熱循環(huán)儀中進(jìn)行，95℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)：94℃變性30 s，47℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。產(chǎn)物置于4℃下保存。將PCR反應(yīng)后的SSR材料每管加上8 μL Loading Buffer，置于PCR儀中95℃變性10 min后取出，放入冰水混合物中冷卻。冷卻后放入4℃冰箱內(nèi)保存，待用。PCR產(chǎn)物以6%聚丙烯酰胺凝膠測序膠為介質(zhì)，以1×TBE為緩沖液，在100 W恒定功率下電泳約50 min，銀染檢測。電泳儀采用Biorad垂直電泳儀，上樣量為8～10 μL。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將各單株的帶型和親本相應(yīng)位點(diǎn)的帶型進(jìn)行比較，與母本類型條帶相同的個(gè)體記為“A”，與父本類型條帶相同的個(gè)體記為“B”，雜合型記為“H”，缺失的記為“-”。

利用Mapmaker/EXP3.0b軟件進(jìn)行連鎖分析，用Mapchart2.1作圖軟件構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜，QTL分析采用WinQTLCartographer v2.0[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 F2群體中皂甙含量的遺傳分布

本試驗(yàn)對(duì)高皂甙含量親本哈91016（♀）、低皂甙含量親本N98-9445A（♂）以及在衍生的F2群體中隨機(jī)抽取的198個(gè)樣本進(jìn)行皂甙含量的測定，后代群體的皂甙含量多數(shù)介于雙親之間，少數(shù)存在超親現(xiàn)象。其中最大值達(dá)到17.8 mg·g-1，大于母本哈91016（13.6 mg·g-1），表現(xiàn)正向超親的占13.9%，而最小值為 6.7 mg·g-1，小于父本 N98-9445A（8.7 mg·g-1），表現(xiàn)負(fù)向超親的占5.2%，說明F2群體皂甙含量具有豐富的遺傳變異?，F(xiàn)將上述F2代群體的皂甙含量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，頻率分布見圖1，并用SPSS 13.0程序進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，F(xiàn)2代單株皂甙含量為連續(xù)變異，且基本符合正態(tài)分布，其偏度為-0.544，峰度為0.52。

2.2 SSR遺傳圖譜的構(gòu)建

根據(jù)對(duì)大豆公共遺傳連鎖圖譜的分析，選擇基本覆蓋大豆全基因組的500對(duì)SSR引物，用于在親本哈91016（♀）和N98-9445A（♂）間進(jìn)行引物多態(tài)性篩選。對(duì)這500對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，有112對(duì)引物具有多態(tài)性，多態(tài)性引物頻率為22.4%。將112對(duì)SSR引物逐一在F2群體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，有106對(duì)多態(tài)性引物在198個(gè)F2群體中擴(kuò)增出多態(tài)性良好、清晰的、穩(wěn)定的產(chǎn)物，多態(tài)性比率為21.2%。

用106個(gè)SSR標(biāo)記鑒定群體染色體組成情況，其中來自哈91016（♀）的染色體片段占整個(gè)群體組成的24.36%，來自N98-9445A（♂）的染色體片段占群體染色體組成的23.28%，來自哈91016（♀）和N98-9445A（♂）的雜合片段占群體染色體組成的 44.36%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)（χ20.05,2=5.52；χ20.01,2=8.67），三者符合期望比率。表明該群體遺傳結(jié)構(gòu)合理，適合遺傳圖譜構(gòu)建和研究。

進(jìn)一步對(duì)這些位點(diǎn)的基因組成進(jìn)行χ2檢測，其中有61%的SSR標(biāo)記在群體中符合理論分離比例，39%的標(biāo)記呈現(xiàn)偏分離的趨勢，但這些標(biāo)記對(duì)于構(gòu)建遺傳連鎖圖譜和進(jìn)行QTL掃描都是比較可靠的。分離群體中標(biāo)記的偏分離現(xiàn)象普遍存在，與已有的報(bào)道相比，本研究中群體的偏分離標(biāo)記比例較高。

圖1 F2代群體表型分布頻率Fig.1 Frequency of phenotype distribution of F2population

將篩選得到的106對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記用于連鎖分析，通過Mapmaker/EXP 3.0b構(gòu)建連鎖圖譜，其中有87個(gè)SSR Marker被分配到1999年Cregan定義的20條染色體中的17條上。這87個(gè)SSR分子標(biāo)記總長約為1 684.3 cM，分子標(biāo)記間的平均距離為19.36 cM，標(biāo)記在連鎖群上的分布是不均勻的，最多的是MLG K和MLG D1b連鎖群，各有10個(gè)標(biāo)記，最少的是MLG A1和MLG E連鎖群，各有2個(gè)標(biāo)記。MLG C2連鎖群最長，為139.6 cM，MLG J連鎖群最短，為14.9 cM。標(biāo)記間大于10 cM的區(qū)段較普遍，可能與連鎖群不同部位發(fā)生交換的幾率不等，或雙親在這些連鎖群區(qū)段遺傳差異巨大有關(guān)，有待于進(jìn)一步在間隙區(qū)尋找新的標(biāo)記，以減小圖距，使遺傳圖譜更加飽和[8-10]。

2.3 與大豆皂甙含量相關(guān)的QTL分析

本研究利用復(fù)合區(qū)間法檢測與大豆皂甙含量有關(guān)的QTL，當(dāng)LOD值大于2.0時(shí)，經(jīng)過WinQTL Cartographer v2.0計(jì)算共鑒定出2個(gè)與大豆皂甙含量相關(guān)的QTL（見圖2），Qts1位于K連鎖群上，標(biāo)記區(qū)間為Sat_044～Satt102，與SSR標(biāo)記Sat_044的遺傳距離是4.6 cM，LOD值2.09，遺傳貢獻(xiàn)率為12.6%，加性效應(yīng)為正值（1.60），Qts2位于D1a連鎖群上，標(biāo)記區(qū)間為Sat_036～Satt580，與SSR標(biāo)記Satt580的遺傳距離是8.9 cM，LOD值2.87，遺傳貢獻(xiàn)率為15.8%；加性效應(yīng)為正值（1.14），表明它的作用方向是增強(qiáng)皂甙含量的作用（見表1）。

圖2 與大豆皂甙含量相關(guān)的QTL定位圖譜Fig.2 Mapping QTLs associated with soyasaponin content

表1 與大豆皂甙含量相關(guān)的QTLsTable 1 QTLs associated with soyasaponin content

3 討論

選擇合適的雙親材料是創(chuàng)建理想作圖群體的關(guān)鍵之一。本研究所用的組合是高皂甙含量品種哈91016（13.6 mg·g-1）和低皂甙含量品種 N98-9445A（8.7 mg·g-1）進(jìn)行雜交所衍生的 F2代群體。F2代皂甙含量高中低分布合理，群體單株的皂甙含量變異范圍較大。正態(tài)性驗(yàn)證結(jié)果表明，該群體皂甙分布偏度為-0.54，所以F2代群體皂甙含量趨于正態(tài)分布，來自哈91016（♀）的基因片段占整個(gè)群體基因組成的24.36%，來自N98-9445A（♂）的基因片段占群體基因組成的23.28%，來自哈91016（♀）和N98-9445A（♂）的雜合基因片段占群體基因組成的44.36%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)（χ20.05,2=5.52；χ20.01,2=8.67），三者符合期望比率。表明該群體遺傳結(jié)構(gòu)合理，是適合品質(zhì)性狀作圖群體。目前，對(duì)于大豆皂甙的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功效、機(jī)理等方面的研究報(bào)道較多，而對(duì)于大豆皂甙含量的分子標(biāo)記方面的研究較少。尤其在國內(nèi)對(duì)于這方面的研究還處在初級(jí)階段。由于親本材料、定位群體的不同，難以對(duì)兩者作進(jìn)一步的比較[11]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)表明，大豆皂甙含量為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳。本研究中得到2個(gè)與大豆皂甙含量相關(guān)的QTL，即：Qts1位于K連鎖群上，標(biāo)記區(qū)間為Sat_044～Satt102，與SSR標(biāo)記Sat_044的遺傳距離是4.6 cM，LOD值2.09，遺傳貢獻(xiàn)率為12.6%；Qts2位于D1a連鎖群上，標(biāo)記區(qū)間為Sat_036～Satt580，與SSR標(biāo)記Satt580的遺傳距離是 8.9 cM，LOD值2.87，遺傳貢獻(xiàn)率為15.8%。

[1]陳學(xué)珍,楊建宇,李欣,等.大豆?fàn)I養(yǎng)與人體健康[J].食品科技,2004(4):5-7.

[2]崔洪斌.大豆生物活性物質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用[M].北京:科學(xué)出版社,2001:114-115.

[3]黃賢校,谷克仁.大豆皂甙研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2006(3):9-12.

[4]王章存,劉衛(wèi)東.大豆皂甙-具有研究開發(fā)價(jià)值的天然活性物質(zhì)[J].食品科學(xué),1995,16(2):3-4.

[5]閆子鵬,薛錦鋒.紫外分光光度計(jì)測定大豆中總皂甙的方法[J].大豆通報(bào),2005(2):28-29.

[6]王珍,方宣鈞.植物DNA分離[M].分子植物育種,2003,1(2):281-288.

[7]Wan G L,Paterson A H.Assessment of DNA pooling strategies for mapping of QTLs[J].Theor Appl Genet,1994,88:355-361.

[9]張立容.SSR和ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(1):90-94.

[10]李一丹,齊東來,高繼國.大豆QTLs研究進(jìn)展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(1):95-98.

[11]Chung J E,Babka H L,Greaf G L,et al.The seed protein oil and yield QTL on soybean linkage group[J].Crop Sci,2003,43(3):1053-1067.