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    高等植物脂氧合酶研究進展

    2010-08-08 06:37:20李彩鳳趙麗影陳業(yè)婷王園園滕祥勇王楠博
    東北農(nóng)業(yè)大學學報 2010年10期
    關(guān)鍵詞:同工酶大豆活性

    李彩鳳,趙麗影,陳業(yè)婷,越 鵬,谷 維,王園園,滕祥勇,王楠博

    (東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,哈爾濱 150030)

    脂氧合酶(Lipoxygenase,編號 EC1.13.11.12,LOX)俗稱脂肪氧化酶、脂肪加氧酶或脂肪氧合酶。分子質(zhì)量范圍一般在90 000~100 000之間,是一種含非血紅素鐵蛋白的氧合酶,酶蛋白由單肽鏈組成,屬氧化還原酶。它是通過專門催化具有順、順-1,4戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸的加氧反應,生成脂肪酸氫過氧化物,而由脂氧合酶啟動合成的一系列環(huán)狀或脂肪族化合物,統(tǒng)稱為氧脂,一般將此代謝過程稱之謂LOX途徑或十八碳酸途徑[1]。在植物界中,脂氧合酶底物主要是亞油酸(LA)、亞麻酸(LNA)等,其加氧位置是C9和C13(見圖1)[2]。

    圖1 LOX亞油酸和亞麻酸等主要底物上的加氧碳位Fig.1 Position of oxygen insertion on of linoleic and linolenic acid

    近些年來,有關(guān)該酶的研究倍受人們關(guān)注。許多研究表明,植物LOXs主要位于原生質(zhì)體、液泡和細胞質(zhì)中[1]。LOX是植物體內(nèi)一類重要同工酶,在植物的生長發(fā)育、成熟衰老以及抵御機械傷害和病蟲侵染等逆境過程起重要的調(diào)節(jié)作用[3],同時植物LOX是一個多基因家族,存在著同工酶,所以在同一物種中,在不同的作用條件下可誘導相應基因的表達,因此本文將對脂氧合酶在高等植物中的酶學特性、生理學功能及分子生物學方面的研究進展作一簡單概括。

    1 脂氧合酶酶學特性

    1.1 脂氧合酶活性部位

    就目前的研究報道來看,LOX活性部位的結(jié)構(gòu)尚不是很清楚,其活性部位的基團可能含有鐵、芳香族氨基酸殘基和蛋氨酸殘基等,但是目前普遍認為催化中心與鐵離子有關(guān),其活化態(tài)為高自旋的氧化型三價鐵,非活化態(tài)為高自旋的還原型二價鐵[4]。LOX活性中心結(jié)構(gòu)使它們對底物有特異性的要求,其抑制劑根據(jù)其來源可分為人工合成的以及天然提取物,其抑制機理包括與底物競爭酶的活性部位、鰲合作用、還原作用和競爭脂質(zhì)自由基[5]。例如,大豆LOX-1模型中,以鐵離子為中心,并且含有不同數(shù)目的內(nèi)源配體和外源配體[6]。Ohta等分析了稻胚中的脂氧合酶同工酶LOX-3的氨基酸組成,發(fā)現(xiàn)它為單一胚,其氨基酸組成與大豆和豌豆的類似,純酶含0.73 Fe atom·mol-1[7]。

    1.2 脂氧合酶催化特性

    在催化反應機理上,Tappel等認為,LOX所催化氧化的亞油酸不同于亞油酸自動氧化過程[8]。首先是亞油酸、氧和LOX形成復合體;再在酶的表面形成一個雙游離基活化體,即一個氫離子和一個電子從亞油酸上轉(zhuǎn)移至氧分子上;雙游離基在酶分子表面結(jié)合形成亞油酸過氧化氫;此過氧化氫物與酶分離并脫落下來。而自由基理論認為:首先氫原子從底物上離開,同時鐵離子被還原;分子氧與底物自由基反應,形成過氧化自由基,在此過程中有可能伴隨O2轉(zhuǎn)變成O2-·自由基,最后過氧自由基被LOX的鐵還原,生成氫過氧化合物,而LOX的鐵轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+,重新轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詰B(tài)[9]。近年來,大豆LOX中質(zhì)子電子的轉(zhuǎn)移反應證實了LOX反應過程中的氫轉(zhuǎn)移理論[10],認為催化的氫原子從底物亞油酸轉(zhuǎn)移到鐵離子上;質(zhì)子和電子同時在供體和受體之間轉(zhuǎn)移;從而產(chǎn)生有效的氫隧道效應。因此,從以上幾種理論都可以看出LOX催化中心與鐵離子有著密切的關(guān)系。

    在應用上,中國對LOX的研究主要集中在活性、pH、溫度或金屬離子絡合劑等影響酶活的因子及產(chǎn)生醛風味物質(zhì)等方面,很少見有關(guān)催化機理、固定化及深層利用方面的報道[11]。國外在LOX固定化方面做過一些工作[12],通過SP-HPLC對幾種水產(chǎn)動植物中LOX催化亞油酸甲酯氧化形成的氫過氧化物進行了定性、定量分析,這也是較突出的一面[13]。

    1.3 脂氧合酶同工酶、最適溫度及pH

    LOX報道始見于1932年,最初研究發(fā)現(xiàn)于大豆植物中[14],因此也就注定了大豆LOX研究是最清楚的,現(xiàn)知道大豆種子中的LOX具有三種同工酶類型,即LOX-1、LOX-2、LOX-3,在受傷后不久的大豆葉片中也已分離出LOX-7、LOX-8兩種同工酶,并發(fā)現(xiàn)這兩種同功酶在幼葉、花和未成熟的莢中都存在,并具有很高的酶活性[15]。目前大豆的LOX-1、LOX-3、兔網(wǎng)織紅血球LOX-1晶體結(jié)構(gòu),這三種生物的LOX已經(jīng)被研究清楚[16]。

    如今已從水稻成熟種胚中也分離出了三種LOX同工酶,根據(jù)層析圖譜洗脫順序的不同,分別定名為水稻LOX-1、LOX-2和LOX-3,其中LOX-1和LOX-2屬于第Ⅱ類LOX,即13-LOX,而LOX-3屬于第Ⅲ類LOX即9-LOX[17]。在水稻不同品種的種子成熟過程中,LOX活性變化規(guī)律不一致。在水稻成熟過程中,種子中LOX-3活性和表達水平都顯著高于其他兩種同工酶,種子萌發(fā)過程中LOX-2活性和表達水平占優(yōu)勢,而LOX-1在種子成熟和萌發(fā)過程中無論在活性和表達水平上都顯示比較低[18]。常見植物LOX性質(zhì)如表1所示[19-24]。

    表1 幾種植物LOX的某些性質(zhì)Table 1 Characteristics of lipoxygenases of several plant

    續(xù) 表

    2 脂氧合酶生理學功能

    2.1 脂氧合酶與衰老

    植物衰老是一種受遺傳和內(nèi)外因子影響,且高度有序細胞程序化死亡的過程。對LOX生理功能的研究表明,在植物的衰老、抗病反應以及其生長過程中LOX都有一定的作用。由于LOX的反應產(chǎn)物可進一步生成自由基,以及細胞膜脂中的多聚不飽和脂肪酸鏈可受LOX催化而導致膜降解,因此,人們自然把LOX與衰老功能相聯(lián)系。植物LOX的生理功能是為植物激素提供合成前體物,如茉莉酸(JA)及其甲酯和愈創(chuàng)激素[25],其代謝產(chǎn)物中含有活性氧和氧自由基,對細胞膜具有一定的破壞作用,因而參與植物的衰老和抗病性過敏壞死反應[26-27]。例如,愈創(chuàng)激素和愈創(chuàng)酸在植物組織傷口愈合時發(fā)生作用,防御受傷組織中病原菌的入侵。而茉莉酮酸類似于脫落酸(ABA),具有抑制生長的作用,因而被認為是植物衰老的促進劑。在植物組織膜脂過氧化作用啟動時,需要脂氧合酶,一旦脂質(zhì)過氧化反應啟動后,LOX便會自我活化,而衰老過程中膜磷脂的逐步降解,則是LOX底物游離脂肪酸的主要來源,LOX過氧化產(chǎn)物可導致組織衰老,其主要機制包括促進合成蛋白質(zhì)酶類的失活、抑制葉綠體的光化學活性以及加速細胞膜的降解。因此,LOX對植物的衰老起著非常重要的作用,但是,只有當生物體發(fā)育到一定階段或受到環(huán)境脅迫時LOX才啟動[28]。例如,綠豆子葉衰老過程中線粒體膜對幾種氨基酸的透性隨衰老進程而下降,表現(xiàn)為離體線粒體膜在脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸等滲溶液中的膨脹率從2天齡到5天齡子葉逐漸下降[29],但是,在整個植物的衰老過程中這幾種氨基酸并不都呈下降趨勢,其原因有待進一步研究。研究表明,隨著果實的成熟和衰老,LOX活性逐漸升高[23]。例如,在蘋果果實發(fā)育及后熟過程中,其幼果期的LOX均出現(xiàn)較高活性高峰,之后下降,至成熟后果實LOX活性又開始提高[30]??梢?,LOX活性表達狀況可能是衡量果實貯藏特性的一個重要因素。

    2.2 脂氧合酶與外界條件

    在植物生長期間,溫度、水分、光照、鹽濃度、抑制劑等都會影響LOX活性變化,在果實成熟及貯藏期間表現(xiàn)得尤為明顯。研究表明,貯藏溫度、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等變化,都會影響果實組織LOX活性變化,但對于非躍變型果實成熟與衰老過程中LOX活性變化情況報道較少[31]。常溫下植物果實軟化衰老加快,LOX活性較高,在貯藏前期,低溫可顯著抑制LOX的活性且在一定程度上延遲了衰老[32]。外施水楊酸處理豌豆葉片可降低其茉莉酸含量,有效抑制LOX活性從而延緩了植物的衰老[33]。

    2.3 植物脂氧合酶活性測定

    目前脂氧合酶測定的方法有很多種,但是每一種測定方法都有其不同的測定原理、參數(shù)及優(yōu)缺點。結(jié)果見表2[34-38]。

    表2 幾種測定脂氧合酶催化活性方法的比較Table 2 Comparison of determination methods of lipoxygenase catalytic activity

    在LOX活性測定的方法上,根據(jù)不同試驗目的的需求在不斷的改進。如今又已開發(fā)研制了植物脂氧合酶同功酶快速檢測技術(shù),是利用脂氧合酶偶聯(lián)氧化還原指示劑產(chǎn)生顯色反應的原理,建立測定LOX同功酶活性的方法。例如,通過此技術(shù)對大豆種質(zhì)資源和后代材料進行篩選,得到大豆脂氧合酶同功酶部分缺失和全缺失材料,以及應用于無豆腥味大豆品種進行輔助育種具有極其重要的意義[39]。通過染色和顯色法快速測定番茄中LOX酶活變化,研究其與果實成熟度和揮發(fā)性香氣成分間的關(guān)系等[40]。

    3 脂氧合酶的分子生物學

    3.1 脂氧合酶基因克隆

    如今研究者已經(jīng)利用分子克隆技術(shù)首次在1987年確定了大豆LOX-1的完整氨基酸序列,并且在研究脂氧合酶誘導防御對于大豆品種的襲擊中表明,消除了LOX同工酶和Kunitz型蛋白酶抑制劑的大豆種子,克服了不良豆腥味大豆產(chǎn)品產(chǎn)生的相關(guān)問題[41]。人們已經(jīng)從擬南芥、番茄、馬鈴薯、煙草、獼猴桃等植物中分別克隆到了多個基因家族成員。根據(jù)GenBank公布的氨基酸序列,構(gòu)建了1個植物LOX基因系統(tǒng)進化樹,得知該系統(tǒng)樹由3個分支組成[42]。而利用獼猴桃EST庫及相關(guān)生物信息學手段,從果肉組織克隆了LOX基因家族成員6個,命名為 AdLOX1~6。AdLOX1、AdLOX2、AdLOX3和AdLOX4為全長cDNA,AdLOX5和AdLOX6為cDNA片段[43]。到目前為止,至少有40多種植物LOX的基因被分離鑒定,這為研究它們之間的系統(tǒng)進化關(guān)系,闡明基因序列、結(jié)構(gòu)、位置特異性和活性之間的關(guān)系提供了可能。

    3.2 脂氧合酶基因表達

    脂氧合酶基因家族在植物界廣泛存,是一個多基因的家族,具有9-LOX和13-LOX兩種類型,存在著不同數(shù)量的同工酶,同一物種的不同發(fā)育階段、以及不同的脅迫作用,可誘導相應基因的表達。研究表明,植物LOX基因的表達貫穿于植物生活史的整個過程,在植物生長發(fā)育的各個階段,包括種子的萌發(fā)、塊莖的形成、結(jié)節(jié)的發(fā)育、果實的成熟以及植物體的衰老,都存在著相應LOX基因表達[44]。例如,煙草Phytopathora parasitica可以誘導LOX在煙草葉片表達并產(chǎn)生過敏性細胞死亡[45]; Hildebran等觀察到大豆葉片受傷后,LOX活性和基因表達都因葉片受傷而增加[46];受發(fā)育信號調(diào)節(jié),一些特異的LOX基因在大麥、黃瓜和大豆種子萌發(fā)的早期階段被誘導[47]。果蔬類已從番茄中克隆到4種不同的LOX基因,即從果實中得到的tomLOXA和tomLOXB,以及從葉片中得到的tomLOXC和tomLOXD[3],并且在不同的組織或同一組織的不同發(fā)育階段有不同的表達模式。不同植物的LOX基因表達已經(jīng)逐漸被研究清楚,說明研究LOX基因技術(shù)也在不斷的發(fā)展成熟中。

    3.3 脂氧合酶基因與逆境

    研究表明,水稻LOX-3是主要的種胚脂氧合酶同工酶,與非轉(zhuǎn)基因植株相比,反義LOX-3轉(zhuǎn)基因植株對水分脅迫、稻瘟病和白葉枯病都表現(xiàn)敏感,說明水稻種胚LOX-3基因在逆境脅迫反應中發(fā)揮一定的作用[48]。許多植物的LOX基因在傷害和病原物誘導下表達。例如,水稻稻瘟病菌可以誘導LOX的表達[49]。此外,國外的研究者在誘導9-LOX耐鹽的鹽細胞臍橙上,為了試圖解決LOX活性的過氧化物的積累作用,分析了細胞中的臍橙,在蛋白的表達條件和壓力下對不同鹽敏感性進行分析,均在體外和體內(nèi)揭示了9-LOX活性和一個非??焖贉p少氫過氧化物的相應羥基衍生物。這表明代謝產(chǎn)物之一在進一步下游還原酶通路可能發(fā)揮關(guān)鍵作用,對鹽脅迫等逆境起著防御作用[50]。

    總之,隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展,使植物LOX生理功能的研究得以加快,這必將有助于深入探討植物LOX基因與逆境調(diào)控的關(guān)系,可為研究植物LOX的作用機制提供新途徑。

    4 脂氧合酶研究展望

    對脂氧合酶的研究大約已有70多年的歷史,無論是在LOX生化特性還是在基因的克隆及表達上都有很大的進步。很多的研究者也開始研究LOX對外界不良的環(huán)境及生理條件的影響,其目的是為了研究出能夠產(chǎn)生抗性的植株。同時研究者也開始利用基因沉默、基因刪除等手段進行轉(zhuǎn)基因植物的研究,同時對LOX產(chǎn)物分析的方法也在不斷地改進,從而大大地推動了LOX途徑及代謝產(chǎn)物生理作用的研究。LOX在工業(yè)上應用前景也將非常廣闊,可用于染料、涂料、洗滌劑或聚氯乙烯增塑劑等的工業(yè)化生產(chǎn)。

    我國對脂氧合酶的研究起步較晚,針對其動力學、分子生物學以及抑制機理的研究是今后應重點加強的。許多試驗表明,LOX具有氧化生物膜的能力,其作用機制有待深入探討。由于脂氧合酶對油脂的氧化作用,導致一些食品品質(zhì)下降,貨價期相對縮短,因此,對脂氧合酶的抑制機理及抑制方法的研究也具有重要的意義。

    此外,利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)手段,從分子水平深入揭示LOX對植物不同器官、組織及細胞衰老的作用機制,進而采用多種方法調(diào)控由多條代謝途徑組成的植物衰老系統(tǒng),設計出更好的調(diào)控衰老戰(zhàn)略方法,并使其應用到經(jīng)濟作物上,這樣才能實現(xiàn)最大的理論和現(xiàn)實價值。

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