蘇云金芽孢桿菌cry1Ac28基因的克隆及原核表達(dá)

曲步云，李海濤，李 明，高繼國(guó)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，它廣泛分布于世界各地，從熱帶雨林到北極凍土帶。已經(jīng)從許多材料上分離獲得該菌，如土壤、植物葉片、鮮水[1]、糞便[2]、動(dòng)物活體[3]、食物、倉(cāng)儲(chǔ)等，是一種對(duì)害蟲(chóng)毒力強(qiáng)且對(duì)天敵無(wú)毒性的昆蟲(chóng)病原微生物，對(duì)高等動(dòng)物和人無(wú)毒性。它是目前研究最為深入、使用最為廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑，對(duì)16個(gè)目3 000多種害蟲(chóng)有活性[4]。Bt在芽孢形成期可形成殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），也稱 δ-內(nèi)毒素（Deltaendotoxin），它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系[5]。該殺蟲(chóng)晶體蛋白分別由cry和cyt基因編碼。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一個(gè)ICPs基因，并于1985年發(fā)表了它的DNA堿基序列及其編碼蛋白的氨基酸序列起，截止目前至少已有447個(gè)ICPs基因被克隆和測(cè)序[6]。從Bt菌株中鑒定到的cry蛋白根據(jù)其氨基酸序列同源性的差異已多達(dá)59類（cry1～cry59）。因此，對(duì)殺蟲(chóng)晶體蛋白的挖掘及研究具有非常重要的實(shí)際價(jià)值。

本研究中Bt Q-12菌株分離自遼寧省鞍山市千山土壤，經(jīng)過(guò)PCR-RFLP鑒定出的含有cry1類基因，成功克隆出了一段cry1Ac全長(zhǎng)序列，構(gòu)建重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌并誘導(dǎo)其高效表達(dá)。本研究為進(jìn)一步研究cry1Ac28蛋白功能和活性打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本文所用菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、加水定容至1 000 mL、pH 7.2、121℃、高壓滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基加入1.3%瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、dNTP（購(gòu)自TaKaRa公司）；PCR引物（由上海生工公司合成），DNA凝膠回收試劑盒和DNA連接酶（購(gòu)自上海生工公司）；其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純以上產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Bt Q-12菌株晶體形態(tài)的觀察

將Bt Q-12菌株接種于LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行涂片、烘干固定，石碳酸復(fù)紅染液染色3 min，清水沖洗，100倍油鏡進(jìn)行鏡檢。

1.2.2 Bt Q-12菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將Bt Q-12菌株接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基試管中30℃，230 r·min-1活化過(guò)夜，1%轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，30℃，230 r·min-1培養(yǎng)，每隔2 h取1 mL菌液測(cè)OD600的吸光值，OD值大于1時(shí)稀釋10倍測(cè)定。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.3 cry1Ac全長(zhǎng)基因的PCR擴(kuò)增

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取、DNA的酶切、連接、感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化和表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。PCR產(chǎn)物回收和純化參照上海生工PCR產(chǎn)物回收試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR-RFLP體系鑒定Bt cry基因和陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選參照宋福平等方法進(jìn)行[8]。

根據(jù)Bt命名中心已公布的cry1Ac類基因的全長(zhǎng)序列[9]，通過(guò)其同源性的比較，設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增全長(zhǎng)序列的引物。

上游引物（Q5unx）：5′CGCGGATCCATGGAT AACAATCCGAACATC3′（Bam HⅠ）

下游引物（Q3unx）：5′ACGCGTCGACCTATT CCTCCATAAGGAGTA3′（SalⅠ）

PCR熱循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃聚合3 min，循環(huán)30次；72℃聚合10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物于0.7%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

回收cry1Ac類基因的全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物，分別對(duì)PCR產(chǎn)物和pEB載體用Bam HⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切并回收，4℃連接過(guò)夜。將CaCl2法轉(zhuǎn)化制備的感受態(tài)E.coli JM109，涂布在氨芐抗性的LB平板上，37℃、12 h，PCR鑒定及酶切分析，篩選出含cry1Ac基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

1.2.5 序列測(cè)定及分析

由上海生工生物工程有限公司完成序列測(cè)定，采用NCBI Balst、DNAMAN等軟件分析序列。

1.2.6 cry1Ac基因的誘導(dǎo)表達(dá)

將獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coli BL21（DE3）中，210 r·min-1、37 ℃培養(yǎng)至 OD600達(dá)到0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol·L-1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，收集誘導(dǎo)培養(yǎng)物，離心收集沉淀。SDS-PAG檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。同時(shí)用0.5 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo) BL21（DE3）空菌株和含 pEB 空載體的菌株、未誘導(dǎo)含pEB空載體的菌株作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt Q-12菌株生物學(xué)特性的分析

2.1.1 Bt Q-12菌株伴胞晶體形態(tài)的觀察

Bt Q-12在LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h可見(jiàn)菌落呈乳白色，表面粗糙不透明，邊緣不整體。挑取單菌落少量，制片，油鏡下觀察，可見(jiàn)伴胞晶體形態(tài)為大小不一的菱形（見(jiàn)圖1）。

由圖1可知，伴胞晶體的形態(tài)因cry基因的不同而不同，因此，根據(jù)顯微形態(tài)的觀察，可以初步推測(cè)菌株所含基因類型，從而推測(cè)Bt Q-12菌株含有cry1類基因。

2.1.2 Bt Q-12菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定

菌株Bt Q-12的生長(zhǎng)曲線如圖2所示，在2～6 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14～18 h進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，穩(wěn)定期的OD600值約為3.5，與其他Bt菌株相比沒(méi)有太大差別。

圖1 Bt Q-12菌株的晶體形態(tài)Fig.1 Crystal shape of Bt Q-12

圖2 菌株Bt Q-12的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of Bt Q-12

2.2 Bt Q-12菌株cry基因類型的鑒定

對(duì)菌株Q-12進(jìn)行基因型的PCR-RFLP鑒定，采用特異引物K5un2/K3un2獲得了大小為1.6 kb的PCR產(chǎn)物（見(jiàn)圖3）。將1.6 kb的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PstⅠ/XbaⅠ酶切，獲得了cry1基因的RFLP圖譜（見(jiàn)圖4），從圖4可以看出，擴(kuò)增獲得的1.6 kb PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后產(chǎn)生了4個(gè)酶切片段，大小分別為1 117、802、518和322 bp。根據(jù)宋福平等的研究結(jié)果（見(jiàn)表2）[8]，說(shuō)明其含有cry1Aa和cry1Aa基因。將PCR產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，通過(guò)K5un2/K3un2引物PCR篩選，得到陽(yáng)性克隆子并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast比對(duì)，確定該因核苷酸序列與cry1Aa最為相似，相似度為97%。

圖3 pMD18-T-cry1Ac的酶切分析與PCR鑒定Fig.3 Restriction analysis and PCR detection of pMD18-T-cry1Ac

圖4 Bt Q-12菌株cry1的PCR-RFLP酶切電泳檢測(cè)Fig.4 PCR-RFLP detection of cry1 from Bt Q-12

表2 cry1類的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和限制性酶切長(zhǎng)度多態(tài)性Table 2 Size of PCR products and their PCR-RFLP patterns of cry1 genes

2.3 cry1Ac全長(zhǎng)基因的克隆

用引物Q5unx/Q3unx擴(kuò)增得到cry1Ac 3.5 kb的全長(zhǎng)基因，用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物和載體pEB，回收、連接、轉(zhuǎn)化JM109，經(jīng)抗性篩選、PCR鑒定及酶切分析，篩選出含基因的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。圖4為陽(yáng)性重組質(zhì)粒酶切分析及PCR鑒定結(jié)果，經(jīng)Bam HⅠ和SalⅠ酶切后，得到大小為5.7 kb的載體條帶和3.5 kb全長(zhǎng)基因條帶，說(shuō)明該表達(dá)載體構(gòu)建正確，該表達(dá)載體命名為pEB-cry1Ac。

2.4 cry1Ac全長(zhǎng)序列及同源性分析

結(jié)果見(jiàn)圖5、6。

圖5 cry1Ac28蛋白的氨基酸組成Fig.5 Amino acids composition of cry1Ac28 protein

通過(guò)DNAMAN軟件分析Bt菌株Q-12編碼區(qū)長(zhǎng)3537 bp。由DNA序列推導(dǎo)的氨基酸為1 178個(gè)，其中在其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸組成中，親水性氨基酸占33.1%，疏水性氨基酸占43.0%，酸性氨基酸占12.9%，堿性氨基酸占11.0%。蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為 133.3176 ku，亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）三種氨基酸含量最高，分別為8.06%、7.80%和7.72%（見(jiàn)圖5），等電點(diǎn)為4.885（見(jiàn)圖6），為弱酸性蛋白質(zhì)。該基因已在國(guó)際基因庫(kù)GenBank中注冊(cè)，登記號(hào)為FJ610439，并經(jīng)Bt δ-內(nèi)毒素基因國(guó)際命名委員會(huì)正式命名為cry1Ac 28。

圖6 cry1Ac28蛋白滴定曲線Fig.6 Titration curve of cry1Ac28 protein

NCBI Blast比對(duì)該蛋白序列與其他cry1Ac基因氨基酸的差異見(jiàn)表3。cry1Ac28與其他cry1Ac基因比較，在結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ存在一些差異，結(jié)構(gòu)域Ⅲ與大部分cry1Ac基因相同。其中與cry1Ac23差異最大，結(jié)構(gòu)域Ⅰ存在9個(gè)差異，結(jié)構(gòu)域Ⅱ存在8個(gè)差異，結(jié)構(gòu)域Ⅲ存在4個(gè)差異。同時(shí)NCBI Conserved Domain Summary分析結(jié)果表明，該蛋白的DomainⅠ由N端第36～254位，共218氨基酸組成；DomainⅡ由第259～461位，共202個(gè)氨基酸組成；DomainⅢ由第470～608位，共138個(gè)氨基酸組成。因此，cry1Ac蛋白的活性區(qū)估計(jì)在N-端的36～608個(gè)氨基酸附近。

2.5 cry1Ac28基因在E.coli BL21(DE3)中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pEB-cry1Ac轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）中，誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)物離心棄上清，SDS-PAGE（8%）。結(jié)果表明，含有pEB-cry1Ac的BL21（DE3）菌在130 ku處有一特異的蛋白帶，與預(yù)期的分子質(zhì)量一致，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的BL21（DE3）空菌株和含pEB空載體的菌株沒(méi)有特異的目的帶產(chǎn)生（見(jiàn)圖7）。應(yīng)用TANON公司凝膠定量軟件GIS3.74分析，cry1Ac28的表達(dá)量占菌體總蛋白的18.2%。

表3 cry1Ac28與其他cry1Ac基因氨基酸差異比較Table 3 Comparison of amino acid sequence between cry1Ac28 and other cry1Ac

圖7 cry1Ac28在BL21(DE3)中表達(dá)蛋白的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE protein which cry1Ac28 expressed in BL21(DE3)

3 討論

自1985年Adang等首次從蘇云金芽孢桿菌庫(kù)斯塔克亞種（Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki）HD73中克隆了第一個(gè)Bt cry1Ac基因（即新的命名系統(tǒng)中的cry1Ac1）以來(lái)[10]，國(guó)際上已有29個(gè)cry1Ac（cry1Ac1-29）基因被陸續(xù)克隆和測(cè)序。

本研究從實(shí)驗(yàn)室分離保存的蘇云金芽孢桿菌分離株中選擇Q-12野生菌株進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定，此野生菌株在LB培養(yǎng)基中產(chǎn)生的菱形晶體特別多，而且重復(fù)性強(qiáng)，菱形晶體蛋白對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)具有特異性，研究這菌株的生物學(xué)特性，對(duì)獲得高毒性的殺鱗翅目的新的Bt菌株具有重要價(jià)值。

菌株的伴胞晶體形狀與殺蟲(chóng)晶體蛋白的類型有關(guān)，cry1類殺蟲(chóng)晶體蛋白的伴胞晶體形狀多為菱形，cry3類蛋白的殺蟲(chóng)晶體蛋白的伴胞晶體多為方形，而鞘翅目害蟲(chóng)蠐螬和雙翅目害蟲(chóng)特異的cry8類蛋白的殺蟲(chóng)晶體蛋白的伴胞晶體多為球形[11]。由此可見(jiàn)，伴胞晶體的形態(tài)因cry基因的不同而不同，根據(jù)顯微形態(tài)的觀察，可以初步推測(cè)菌株所含基因類型。本試驗(yàn)首先通過(guò)鏡檢觀察Q-12具有菱形伴胞晶體就可初步推測(cè)其含有cry1基因。因此，在對(duì)具有未知?dú)⑾x(chóng)基因經(jīng)進(jìn)行鑒定之前，仔細(xì)分析菌株的殺蟲(chóng)蛋白晶體特點(diǎn)對(duì)其進(jìn)一步研究極其重要。

該基因表達(dá)載體的構(gòu)建是應(yīng)用的多功能高效表達(dá)載體pEB。pEB是利用引物從克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)pETblue-2質(zhì)粒上擴(kuò)增出該質(zhì)粒的表達(dá)區(qū)。目的基因被克隆到pEB質(zhì)粒載體上，受噬菌體T7啟動(dòng)子強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制，表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7RNA聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性，在IPTG充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個(gè)小時(shí)，目的蛋白通常可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上。該載體的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是在非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄。故在本試驗(yàn)中我們選擇了pEB作為表達(dá)載體，研究結(jié)果表明cry1Ac28基因在pEB中能實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的表達(dá)?？梢?jiàn)在做原核表達(dá)之前選擇表達(dá)系統(tǒng)（受體菌和表達(dá)載體）非常重要。另外，在選擇了合適表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)速等條件進(jìn)行優(yōu)化后能提高目的蛋白的表達(dá)量。本試驗(yàn)之前在37℃條件下，可溶性蛋白極少，之后改變溫度將誘導(dǎo)溫度選擇在20℃，降低IPTG濃度，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，并選擇較低的搖床轉(zhuǎn)速等。

對(duì)cry1Ac28蛋白的生物信息學(xué)分析研究揭示出了與其他已知的cry1Ac基因的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ存在一些差異，結(jié)構(gòu)域Ⅲ與大部分cry1Ac基因相同，說(shuō)明來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的菌株所含的同一亞類基因保守性較強(qiáng)。結(jié)構(gòu)域Ⅰ位于殺蟲(chóng)晶體蛋白的N端是疏水的部分，具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，是發(fā)揮特異毒力的功能區(qū)域[12]。任羽等研究結(jié)果表明[13]，在結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的突變更容易產(chǎn)生活性提高的突變蛋白，而結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ較難獲得毒力提高的突變蛋白，由此可以預(yù)測(cè)cry1Ac28蛋白也可能是高毒力蛋白。進(jìn)一步研究cry1Ac28蛋白的構(gòu)象及殺蟲(chóng)活性，對(duì)擴(kuò)大Bt菌株的殺蟲(chóng)譜、增強(qiáng)菌株毒力、構(gòu)建高效廣譜殺蟲(chóng)Bt工程菌均具有現(xiàn)實(shí)意義。

4 結(jié)論

本研究以本實(shí)驗(yàn)室分離的Bt菌株Q-12為研究對(duì)象，經(jīng)過(guò)PCR-RFLP鑒定出的含有cry1類基因，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增出cry1Ac基因完整的開(kāi)放閱讀框（ORF）的引物對(duì)Q5unx和Q3unx，克隆得到cry1Ac全長(zhǎng)基因。該基因編碼區(qū)為3 537 bp，編碼1 178個(gè)氨基酸，已正式被蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素命名委員會(huì)命名為cry1Ac28。成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體（pEB-cry1Ac），并實(shí)現(xiàn)了高效特異性蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量為133.3176 ku。以上研究結(jié)果為進(jìn)一步研究cry1Ac28蛋白功能和活性打下了良好的基礎(chǔ)。

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