下咽癌中hMLH1和hMSH 2蛋白的低表達及臨床意義

郭 淼,張 超,蘆二永,趙 曉

hMLH 1 與 hMSH 2 是人類錯配修復(fù)基因(humanemismatch repair gene, hMMR)家族中非常重要的兩個基因,維持著DNA復(fù)制的高保真性及起著控制基因突變的作用,它們的功能缺陷被認為是腫瘤發(fā)病的重要機制之一,并成為近年來研究的熱點。有研究表明, hMMR與食管癌、胃癌、宮頸癌等腫瘤[1]關(guān)系密切,但在下咽癌中的表達狀況國內(nèi)尚未見報道。本實驗通過免疫組化方法檢測下咽癌和正常喉組織中的hMLH1 和hMSH2 蛋白的表達狀況,探討它與下咽癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料來源下咽癌包括梨狀窩癌、環(huán)后癌、咽后壁癌,因后兩種類型較少見,且以放化療為主,故本研究主要討論梨狀窩癌。所檢測組織選自河南科技大學第一附屬醫(yī)院2008 ～2010年耳鼻喉科、頭頸外科手術(shù)切除存檔的下咽癌石蠟標本50例,標本均為第1次住院的原發(fā)下咽癌(梨狀窩癌),術(shù)前未進行放療和化療;另選正常喉組織20例作對照。50例下咽癌病例中, T1期16例, T2期24例, T3期10例,T4期0例;高分化鱗癌25例,中分化鱗癌15例,低分化鱗癌10例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例。

1.2 試劑鼠抗人MLH1、MSH2單克隆抗體試劑,廣譜SP試劑盒, PBS磷酸鹽緩沖液等,均采購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3 實驗方法采用免疫組化SP法,試驗中染色過程按照北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供的SP試劑盒說明書進行。用北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供的陽性照片作陽性對照,以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定hMLH1、hMSH2蛋白表達主要位于細胞核和(或)胞漿,胞核和(或)胞漿有棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機觀察5個高倍視野,每個視野記數(shù)100個細胞,陽性細胞數(shù)<10%為陰性片,陽性細胞數(shù)>10%為陽性片。

1.5 統(tǒng)計學處理實驗所得數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行處理,采用2檢驗分析結(jié)果, P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 50 例下咽癌、20 例正常喉組織中hMLH1、hMSH2蛋白陽性率分布見表1,兩組hMLH1蛋白表達差異比較χ2=4.076, P<0.05, hMSH2蛋白表達差異比較χ2=5.23, P<0.05。hMLH1、hMSH 2蛋白在兩種組織中的陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 hMLH 1和hMSH 2蛋白在下咽癌和正常喉組織中的表達n(%)

2.2hMLH1、hMSH2蛋白的表達與下咽癌臨床病理特征的關(guān)系hMLH1、hMSH2蛋白在下咽癌T分期組間的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但在不同分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 hMLH 1、hMSH 2蛋白的表達與下咽癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

下咽癌的發(fā)病機制與其他系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機制相似,都與分子水平的基因突變有關(guān),人體細胞中的DNA錯配修復(fù)反應(yīng)過程依賴于幾種人類錯配修復(fù)基因產(chǎn)物的參與。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9 個錯配修復(fù)基因[2], 分別 是 hMSH 2、hMSH6、hMSH 5、hMSH4、hMSH3、hMLH1、 hPMS1、hPMS2、hMLH3。 hMLH1、hMSH2是其中較為重要的兩種,若其中任何一種基因發(fā)生突變導(dǎo)致其產(chǎn)物功能的喪失都將會造成DNA錯配修復(fù)功能的異常、缺陷或者喪失。 DNA錯配修復(fù)功能的異常、缺陷或喪失將會出現(xiàn)微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性或復(fù)制錯誤陽性,使整個基因組不穩(wěn)定性增加,從而引起包括癌基因和抑癌基因的一系列改變,發(fā)生各種腫瘤[3]。研究證明HMMR功能異常與呼吸、消化道和泌尿系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病有密切關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn), hMLH1和hMSH2在下咽癌中表達陽性率明顯低于在正常喉組織中的表達陽性率,在下咽癌中hMLH1和hMSH 2蛋白陽性表達率分別為54%和56%,在正常喉組織中的陽性表達率為80%和85%。由此可以認為,這兩種蛋白的表達在正常喉組織和癌組織由高到低的變化,可能是下咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的一個重要事件,其中表達量下調(diào)可能助長了細胞的異常增殖活動,促進腫瘤的發(fā)生。這兩個蛋白在癌組織中的表達各家報道不一,唐郡等采用免疫組化的方法檢測144例食管鱗癌手術(shù)切除標本、30例正常黏膜組織中hMSH2和hMLH1表達情況,并與臨床病理參數(shù)作相關(guān)分析,結(jié)果食管鱗癌組織hMLH1和 hMSH2基因陽性表達明顯下降,與正常食道黏膜相比相差顯著(P<0.01)。 hMLH1和hMSH2表達缺失與年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度無明顯相關(guān),與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.01)[4]。以上研究均表明多種惡性腫瘤的發(fā)生都伴隨著錯配修復(fù)蛋白結(jié)構(gòu)或功能的異常,常表現(xiàn)為hMLH1和(或)hMSH2蛋白表達的減少。但也有研究發(fā)現(xiàn)相反的結(jié)論,范凱[5]等研究結(jié)果顯示,hMSH2蛋白在胃癌中的陽性表達率40%,較正常胃組織中高,董莉[6]等研究發(fā)現(xiàn)hMSH2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中高表達,出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是在一些致癌因素長期反復(fù)的刺激下,某些增殖活躍的細胞會出現(xiàn)基因的多點突變以及DNA復(fù)制上的錯誤,導(dǎo)致hMSH2蛋白代償性的表達上調(diào)。

本研究還發(fā)現(xiàn), hMLH1和hMSH2兩種蛋白在臨床分期中的表達差異無統(tǒng)計學意義,而在高分化、中分化到低分化下咽癌中兩種蛋白的陽性表達率有顯著下降。對于惡性腫瘤來說,分化程度是腫瘤的惡性程度及預(yù)后的重要指標之一,因此檢測hMLH1 和hMSH2兩種蛋白對于下咽癌的預(yù)后有非常重要的意義。另外在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的下咽癌病例中, hMLH1和hMSH2兩種蛋白的陽性表達率顯著低于沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例,由此認為hMLH1和 hMSH2蛋白與下咽癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),在下咽癌的發(fā)展過程中持續(xù)作用。本實驗研究結(jié)果與大多數(shù)研究結(jié)果類似[4,7]。

綜上所述, hMLH 1和hMSH 2蛋白在下咽癌中的表達下調(diào),可能在下咽癌早期發(fā)生中起著重要的作用,并且這兩種蛋白的表達程度很可能與下咽癌的發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系。因此,聯(lián)合檢測hMLH 1和hMSH2基因蛋白將在下咽癌早期的預(yù)警、診斷及其預(yù)后評估中產(chǎn)生重要的臨床意義,并可能成為基因治療新的靶點。

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