腎性高血壓大鼠模型制作的改良方法

曹珊珊,李瑞芳,方偉進,李 艷,王建剛,杜景霞,黃國輝

目前,國內(nèi)外常利用犬、大鼠、兔等動物制作高血壓模型,其中腎動脈狹窄性高血壓模型由于簡便可靠被廣泛應用于人類高血壓及并發(fā)癥的研究。腎血管性高血壓(reno vascular hypertension, RVH)是指單側(cè)或雙側(cè)腎動脈的主干或其分支狹窄,使腎血流量減少,導致腎缺血引起的高血壓,為繼發(fā)性高血壓最為常見的病因。 RVH模型是高血壓發(fā)病機制研究和藥物評價的常用動物模型,我們通過摸索,對現(xiàn)有的雙腎雙夾(two kidneys two clips, 2K 2C)高血壓模型制作方法進行了改良,獲得了理想的成模率,同時減少了實驗并發(fā)癥的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 藥品及儀器戊巴比妥納(中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司);鈦合金制“U”型夾(鄭州),規(guī)格:內(nèi)徑0.3 mm;手術絲線, 規(guī)格(5/0);青霉素G(華北制藥),規(guī)格80萬U/瓶;紅霉素軟膏;75%酒精;生理鹽水;BP-6無創(chuàng)動物血壓測試儀(四川);BL-420生物機能實驗測試儀(上海)。

1.2 實驗動物及分組成年健康雄性SD大鼠94只(體質(zhì)量100±10 g,由河南科技大學醫(yī)學院實驗動物中心提供),隨機分為假手術組(20 只)和模型組(74只)。大鼠分籠飼養(yǎng)于室溫18 ～25℃,日照12 h,相對濕度45%～55%,通風良好的環(huán)境中,飼喂普通飼料,自由飲水。

1.3RVH的模型制作腹腔注射1 %戊巴比妥納溶液(35 mg/kg),麻醉SD大鼠, 15 ～20 min后大鼠即被麻醉。俯臥位固定備皮消毒后,于第3腰椎棘突水平沿背部后正中線切開皮膚3 ～4 cm,用棉簽鈍性分離雙側(cè)皮下淺筋膜,狹窄左腎動脈時,于約第十二胸椎水平距棘突旁約1.5 cm處用直剪剪開肌腱、腹膜進入腹腔,用棉簽沾生理鹽水后入腹腔探測腎臟位置,根據(jù)腎門的具體位置沿棘突方向擴大手術開口直至腎臟及腎門清晰地暴露于視野下。左腎動靜脈包裹在一個血管鞘中,通常情況下左腎動脈位于深靜脈的上后方(偶爾會出現(xiàn)在腎靜脈下方或橫跨在腎靜脈的上方),可用濕潤生理鹽水的棉簽撥開腎靜脈,再用無齒小彎鑷在動靜脈之間小心分離,分離出左腎動脈約0.5 cm,將一內(nèi)徑為0.3 mm的鈦合金夾呈水平方向套在左腎動脈上,務必使左腎動脈全部落入鈦合金夾頂部的圓形小孔內(nèi),再用小直鑷夾閉兩腳,以狹窄后左腎顏色變?yōu)椤皽\紅色”為宜。向腹腔內(nèi)注入青霉素G 4萬U,關閉腹腔開口。狹窄右腎動脈時,手術開口較左腎開口處高約1 cm,暴露右腎及右腎蒂,右腎動脈位置變異少,且與右腎靜脈相距稍遠,較左腎動脈易于分離。在下腔靜脈和腹主動脈之間與右腎水平線相交處分開腹膜后壁,即見右腎動脈,分離狹窄右腎動脈,具體方法同左腎動脈。多數(shù)情況下肉眼可見右腎動脈直徑較左腎動脈大,故鈦合金夾直徑的選擇上亦可以視具體情況進行調(diào)整,本研究常用0.3 ～0.35 mm內(nèi)徑鈦合金夾狹窄右腎動脈,亦以狹窄后右腎顏色變?yōu)椤皽\紅色”為宜。后注入青霉素G 4萬U,關閉右側(cè)腹腔。雙腎動脈狹窄都完畢后,行腹腔、肌層全層連續(xù)縫合,再注入青霉素G 4萬U后,間斷縫合皮膚,用碘伏再次消毒皮膚縫合口,去除血跡,對皮,涂上紅霉素軟膏,手術完成。假手術組僅游離左、右腎動脈,不予狹窄,其余過程同手術組。待動物蘇醒后,放入單籠飼養(yǎng),注意保持呼吸道通暢,用100 W白熾燈距離60 cm照8 h以保溫,術后禁食24 h,但不禁水,術后3 d密切觀察皮膚切口,精神狀態(tài)及進食進水情況。于術后3 d開始每天注射青霉素G 8萬U,共5 d。

1.4 血壓測量無創(chuàng)血壓測量:采用BP-6無創(chuàng)動物血壓測試儀測定大鼠清醒狀態(tài)下尾動脈血壓。將大鼠置于儀器配套的固定籠中,置30℃恒溫箱預熱15 min,待大鼠完全安靜后將鼠尾套袖放置于鼠尾的根部,套袖以約20 ～30 mmHg/s的速度自動充氣加壓直至脈搏波消失,維持6 s后套袖自動放氣,出現(xiàn)的第1個血壓波即為收縮壓。連續(xù)測量至少3 次,每次測量間隔一定時間, 記錄心率(HR≤10 次/min)、血壓(BP≤6 mmHg)的3次讀數(shù),取其均數(shù)為當天收縮壓值,以此法測量大鼠術前血壓,每周測壓1次,進行血壓的動態(tài)觀察。有創(chuàng)血壓測量:各組動物在觀察期滿后用1%的戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔麻醉,導管內(nèi)充滿肝素,右頸總動脈逆行插管至左心室,另一端接BL-420生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),導管口在右頸動脈內(nèi)時,連續(xù)記錄血壓5 min。取平穩(wěn)的一段血壓曲線記錄主動脈收縮壓和舒張壓(AOSP, AODP)進入左心室后測左室收縮末壓和左室舒張末壓(LVESP, LVEDP),室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dP/dtmax)和心率(HR)。

1.5 高血壓模型成功的標準血壓在 85 ～120 mmHg范圍為正常血壓大鼠,以2K2C手術4周后動物血壓明顯升高超過自身術前血壓30 mmHg以上,且解剖后雙腎無壞死,萎縮或纖維化為模型復制成功;術后血壓無明顯升高或死亡者為失敗。

1.6 左心室質(zhì)量指數(shù)的測定試驗結(jié)束時,大鼠插管測壓后,開胸取出心臟,置于預冷的生理鹽水中,濾紙吸干后稱心臟重量(HW)。沿房室環(huán)剪去左、右心房及右心室游離壁,用電子天平稱取左心室(包括室間隔)重量(LVW),并與體重(BW)相除,計算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。

1.7 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,結(jié)果以±s表示,組間比較采用t檢驗, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 模型成活率本實驗共使用94只大鼠進行造模,假手術組(n=20), 2K2C組(n=74);研究觀測直至6周末,經(jīng)檢測, 82只大鼠成活,模型成活率為87%。 2只麻醉過淺術中掙扎出血死亡, 4只麻醉過深術后未蘇醒,麻醉死亡占6.4%;2只術后1 h內(nèi)死亡,多考慮是急性腎功能衰竭,占2.1%;4只于術后1周內(nèi)感染死亡,占4.3%。術后6 周有4只血壓上升小于30 mmHg,模型成功率為83%。見表1。

表1 實驗大鼠成活、成模情況

2.2 血壓升高情況術前我們用無創(chuàng)血壓儀對大鼠進行測壓,選取血壓小于120 mmHg的大鼠為實驗對象,術后6周,經(jīng)頸總動脈插管有創(chuàng)測壓,假手術組的血壓和術前相比無顯著差異,實驗組血壓明顯上升, 6周末維持在165 mmHg左右,并趨于穩(wěn)定,血壓和心功能見表2。

表2 術后6周大鼠血壓及心功能變化情況

2.3 右心室質(zhì)量指數(shù)從表3可以看出,實驗組-6周與對照組-6周組相比,體重無顯著差異(P>0.05),左心室重(LVW)、左心室重/體重(LVW/BW)顯著增加(P<0.01)。

表3 體重和左心室質(zhì)量指數(shù)

3 討論

腎動脈狹窄性高血壓模型是應用廣泛的高血壓動物模型,復制方法主要有幾種, 1K1C(一側(cè)腎動脈狹窄,另一側(cè)腎切除), 2K1C(一側(cè)腎動脈狹窄,另一側(cè)腎保留),和2K2C(雙腎動脈均狹窄)。狹窄腎動脈的方法眾多,或用套管、或用U型銀夾、或用有機玻璃夾、或用絲線結(jié)扎、或用自制鋁夾等方法[1]。套管法在體型較大的動物如狗等效果明顯,但小型動物不易開展;U型銀夾套入血管后需用眼科鑷夾閉兩腳,致使腎動脈狹窄程度不易控制,易造成急性腎功能衰竭;有機玻璃夾亦需特殊的工具研制;而絲線結(jié)扎的效果不太穩(wěn)定。采用背部開口,因為腎臟是腹膜后器官,與腹部開口相比,在手術過程中不需將腸管、腹腔臟器翻出腹腔,避免損傷肝臟、乳糜池、腹腔內(nèi)血管,同時可以避免由于腸管復位錯亂造成術后腸扭轉(zhuǎn)或腸梗阻。術后傷口愈合較腹部開口快,采用的鈦合金夾在體內(nèi)不會被氧化,實驗結(jié)束后可回收反復利用,節(jié)約了實驗成本。

關于2K2C法成功復制RVH模型,應注意以下幾點:①麻醉:麻醉深度對于模型的制作亦很重要。麻醉過深,術后蘇醒較慢,甚至死亡。本研究中4 例大鼠死于麻醉過度;麻醉過淺動物掙扎則易出現(xiàn)出血、腹臟器損傷、拖延手術時間,試驗中2例大鼠因麻醉較淺,出現(xiàn)上述情況致腎靜脈大出血。雖然麻醉劑有一定的合適劑量范圍,由于不同批次大鼠體質(zhì)不同,產(chǎn)生麻醉的效果也不同。因此在每次大規(guī)模實驗前均必須摸索適宜的麻醉劑的劑量。 ②鈍性分離,減少出血,筋膜剝離需干凈。雖然模型制作簡單,術后的出血和感染仍是手術最為常見的并發(fā)癥。初學模型制作時,術后出血是大鼠死亡最常見的原因。由于腎動、靜脈緊貼伴行,因此,鈍性分離動靜脈之間的筋膜時,需撥開靜脈,避免損傷靜脈,減少和避免術后出血是模型成功制作的關鍵[2]。本研究中有2例大鼠死于腎功能衰竭,分離腎動脈時,必須注意筋膜是否分離干凈,上夾后夾子能否沿動脈滑動,已證實腎素—血管張素系統(tǒng)是腎血管性高血壓大鼠腎功能衰竭的重要原因[3]。 ③避免牽拉,縮短手術時間。雙腎上夾應在5 min內(nèi)完成。另外,熟練的操作可避免由于腎血管的反復牽拉致腎臟長期缺血或淤血,操作時間過長易引起的感染,在我們的研究中發(fā)現(xiàn)這些因素均與術后死亡有關。④避免手術感染。研究發(fā)現(xiàn),相當部分的大鼠死亡發(fā)生于術后1個月,術后感染是常見原因,所以嚴格、細致的管理也是模型成功的重要方面。保持飼養(yǎng)房空氣流通和適宜的溫度最為重要,一般飼養(yǎng)區(qū)內(nèi)溫度必須保持在19 ～29 ℃[4,5]。我們在術前用硫化鈉對大鼠背部進行褪毛備皮,避免術中鼠毛掉至腹腔中,術中每側(cè)夾子安放完畢都腹腔給予少量青霉素G,術后再連續(xù)5 d腹腔注射青霉素G,都是為了避免因感染造成的死亡。我們動態(tài)觀察了實驗組術后血壓的變化,結(jié)果術后2周血壓即明顯升高,超過自身基礎血壓30 mmHg以上, 6周時已經(jīng)能夠形成穩(wěn)定高血壓,血壓值維持在165 mmHg范圍,模型復制成功率為83%,與文獻報道相近,說明我們的模型制作方法可行。

[1] 王東,蔣湘蓮, 聶亞雄.高血壓大鼠模型的研究進展[J].中國動脈硬化雜志, 2006, 14(3):271-276.

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