含溶栓顆粒血清對TNF-α損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的影響1)

臧運(yùn)華,唐 明,郭瑞友,葉俊麗,曹曉嵐

腦缺血是一種腦循環(huán)血流量下降為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,是當(dāng)今疾病中主要致殘、致死原因之一。近年來研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞不僅是機(jī)械性防御結(jié)構(gòu),而且是體內(nèi)最大的“內(nèi)分泌器官”,可以生成血管活性物質(zhì),參與血流動(dòng)力學(xué)、血管通透性的調(diào)節(jié),在血栓形成、脂質(zhì)沉積、細(xì)胞黏附等方面均有重要作用。

溶栓顆粒(枳實(shí)、柴胡、地龍、水蛭等組方)是在臨床治療缺血性中風(fēng)病的有效方劑。前期研究發(fā)現(xiàn)溶栓顆粒對大鼠缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用。本研究旨在觀察溶栓顆粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量250 g～280 g,購自青島市藥檢所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),購自北方偉業(yè)科技有限公司。DM EM培養(yǎng)液和胎牛血清、胰酶(1∶250)(美國GIBCO公司);Ⅰ型膠原酶、L谷氨(美國Gibco公司)。VEGF免疫組化試劑盒,購自武漢博士德科技有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購自上海天呈生物信息科技有限公司。溶栓顆粒由枳實(shí)、柴胡、地龍、水蛭等組成,每包14 g(含生藥64 g)由青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)制劑實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 含藥血清制備 Wistar大鼠20只(雄性),隨機(jī)分為空白組、中藥大劑量組、中藥中劑量組、中藥大劑量組?？瞻捉M灌胃蒸餾水,中藥大、中、小劑量組分別予0.2 g/L、0.1 g/L、0.05 g/L溶栓顆粒2m L灌胃,共灌胃3 d,于最后1次給藥后分別于1 h、1.5 h、2 h無菌條件下腹主動(dòng)脈取血,離心分離血清,不同時(shí)間取同一組血清混合后經(jīng)56℃、30 min滅活,用0.22μm微孔濾膜過濾除菌,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。各組含藥血清為:正常血清、大劑量中藥血清、中劑量中藥血清、小劑量中藥血清。

1.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株的培養(yǎng) HUVEC用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置孵箱(37℃,5%CO2)培養(yǎng)。鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù),待細(xì)胞達(dá)對數(shù)增長期,實(shí)驗(yàn)共分6組,接種于24孔培養(yǎng)板,接種密度3×104/m L,為空白組、模型組、正常血清組、大劑量中藥組、中劑量中藥組、小劑量中藥組。分組后置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱孵育,除空白組外各組加入TNF-α40 ng/m L孵育6 h,用含藥血清處理24 h后檢測?？瞻捉M:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液;模型組:人HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育。正常血清組:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加正常血清。大劑量中藥組:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加大劑量中藥血清。中劑量中藥組:HUVEC加DMEM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加中劑量中藥血清。小劑量中藥組:HUVEC加DM EM培養(yǎng)液加TNF-α孵育加小劑量中藥血清。

1.4 培養(yǎng)細(xì)胞VEGF檢測 按照免疫組化試劑盒說明進(jìn)行。培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)觀察采用HE染色,光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用方差分析和t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察 模型組、正常血清組HUVEC細(xì)胞數(shù)量下降,皺縮、變形,分裂相細(xì)胞明顯增加,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化:血管內(nèi)皮細(xì)胞部分呈明顯的長梭形、星形,似成纖維細(xì)胞樣改變,細(xì)胞間隙增大。中藥大、中、小劑量組細(xì)胞密度大于模型組及正常血清組,分裂相細(xì)胞少于模型組及正常血清組。每組各觀察10個(gè)放大200倍光鏡下視野所記錄的有絲分裂細(xì)胞數(shù)。詳見表1。

表1 各組有絲分裂細(xì)胞數(shù)比較

2.2 VEGF蛋白表達(dá) 胞漿內(nèi)棕黃色顆粒的是陽性細(xì)胞?？瞻捉MHUVEC細(xì)胞漿內(nèi)沒有或有少量棕黃色顆粒,染色很淺。模型組、正常血清組HUVEC有較多細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒,染色較深。大、中、小劑量中藥組胞漿含黃色顆粒細(xì)胞較少,染色較淺。表明空白組不表達(dá)VEGF蛋白,模型組、正常血清組及大、中、小劑量中藥組有VEGF蛋白表達(dá),各劑量中藥可減少VEGF蛋白表達(dá)。各組10×40倍光鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野,計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)量。詳見表2。

表2 各組VEGF蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量比較

3 討 論

近年來研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞不僅是機(jī)械性防御結(jié)構(gòu),而且是體內(nèi)最大的“內(nèi)分泌器官”,可以生成血管活性物質(zhì),參與血流動(dòng)力學(xué)、血管通透性的調(diào)節(jié),在血栓形成、脂質(zhì)沉積、細(xì)胞黏附等方面均有重要作用。隨著對細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)研究的不斷深入,已證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞還具有產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用,可通過旁分泌或自分泌形式在其生成的微環(huán)境中直接發(fā)揮作用,或進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),引起全身效應(yīng)[1]。

前期研究發(fā)現(xiàn),溶栓顆粒腦保護(hù)作用可能存在以下機(jī)制:抑制由白介素-1β(IL-1β)介導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng);抑制白細(xì)胞黏附鏈條式過程中的IL-1β和細(xì)胞黏附分子-1(ICAM-1)產(chǎn)生環(huán)節(jié),從而減少白細(xì)胞黏附造成的腦組織損傷[2];降低丙二醛(MDA)的過量釋放、提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強(qiáng)抗脂質(zhì)過氧化能力;降低TNF-α的過量釋放、減少腦含水量[3];抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達(dá),從而減少由MMP-9所造成的血腦屏障通透性增加和腦水腫及對腦組織的直接損傷[4]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂原,屬分泌性糖蛋白,具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、加速新血管形成,增強(qiáng)血管通透性等作用[5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞正常時(shí)不表達(dá)VEGF,但在血管內(nèi)皮細(xì)胞被置于缺氧環(huán)境時(shí)細(xì)胞內(nèi)VEGF明顯增加。

炎癥因子可一定程度地促進(jìn)VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。炎癥因子對動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響是一個(gè)多因素調(diào)控的復(fù)雜過程,本研究顯示TNF-α增加VEGF表達(dá),可能是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的機(jī)制之一。在TNF-α損傷狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)增加,血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖增加,加快動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成,增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性。這可能是炎性介質(zhì)誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化形成以及破裂的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn),溶栓顆粒對HUVEC有保護(hù)作用,能夠減少TNF-α對內(nèi)皮細(xì)胞的損害。溶栓顆粒的這一作用可能由于減少VEGF的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。其中,大劑量和中劑量溶栓顆粒效果較明顯,而小劑量中藥組并未顯示出明顯的降低VEGF表達(dá)作用。小劑量中藥組以及正常血清組相對于不加入大鼠血清的模型組有減少趨勢,抑制VEGF表達(dá)的作用相當(dāng),考慮或許單純增加血清含量也能減少VEGF表達(dá),其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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[3] 曹曉嵐,任麗,臧運(yùn)華.溶栓顆粒對腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2005,3(1):37-38.

[4] 臧運(yùn)華,曹曉嵐,賀青濤,等.溶栓顆粒對缺血再灌注損傷大鼠IL-1β及MMP-9的影響[J].山東中醫(yī)雜志,2006,25(6):409-411.

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