傷害脅迫對(duì)合作楊葉片膜質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化酶活性的影響

安鈺,沈應(yīng)柏,張志翔

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院荒漠化治理研究所,銀川750002;2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083）

當(dāng)植物受到機(jī)械損傷、昆蟲(chóng)取食等非生物和生物脅迫時(shí),會(huì)產(chǎn)生一系列防御反應(yīng),這些防御反應(yīng)一方面有助于受損部位愈合,另一方面誘導(dǎo)全身反應(yīng)進(jìn)一步阻止傷害的發(fā)生[1-2]。近年來(lái)關(guān)于傷害誘導(dǎo)植物體內(nèi)生理生化變化方面的研究報(bào)道有很多,在傷害脅迫研究領(lǐng)域人們?nèi)找骊P(guān)注活性氧(ROS)的產(chǎn)生和細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)系[3-5]。正常情況下,植物依賴其體內(nèi)存在的 ROS清除系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸等維持自由基生成與消除的動(dòng)態(tài)平衡。但另一方面,ROS積累可導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化和膜透性喪失,從而引起植物體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化變化、代謝紊亂,使植物受到傷害。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)不同損傷形式誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生的防御反應(yīng)也存在差異。Maffei等[6]研究表明,經(jīng)棉貪夜蛾(Spodoptera littoralis)取食和機(jī)械損傷的利馬豆(Phaseolus lunatus)葉片中,鈣離子和活性氧的積累,及抗氧化酶活性和基因表達(dá)都表現(xiàn)出明顯差異。但也有研究表明,連續(xù)的機(jī)械損傷能夠誘導(dǎo)利馬豆釋放出與棉貪夜蛾取食非常相似的揮發(fā)物,機(jī)械損傷完全能夠模擬昆蟲(chóng)取食[7]。因此,機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食能否誘導(dǎo)相同的防御反應(yīng),機(jī)械損傷能否完全替代昆蟲(chóng)取食,還存在爭(zhēng)議。

合作楊(Populussimonii×P.pyramidaliscv.‘Opera 8277')是雜交品種,具有扦插育苗易生根、易繁殖、造林成活率高、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快等特點(diǎn),是我國(guó)北方地區(qū)特別是黃土高原以及“三北”地區(qū)主要的造林樹(shù)種,但其極易受到病蟲(chóng)危害,給林業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展造成重大損失。因此,本試驗(yàn)以合作楊為材料,研究了昆蟲(chóng)取食和機(jī)械損傷對(duì)合作楊葉片膜質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化酶活性的影響,并對(duì)抗氧化酶在合作楊抗病蟲(chóng)防御反應(yīng)中的作用進(jìn)行了探討,以期為建立新的無(wú)公害病蟲(chóng)害防治方法提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以1年生合作楊(Populus simonii×P.pyramindaliscv.‘Opera 8277')扦插苗為試驗(yàn)材料。3月份將插條扦插于直徑25 cm、盛有果園土的塑料盆中,定期澆水,緩苗后定期供給Hoagland營(yíng)養(yǎng)液,以避免產(chǎn)生干旱脅迫或缺乏營(yíng)養(yǎng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)于7月份進(jìn)行,選取長(zhǎng)勢(shì)較好且一致的幼苗。

實(shí)驗(yàn)用蟲(chóng)為楊扇舟蛾(Clostera anachoretaFabricius)3齡幼蟲(chóng),由通州區(qū)小耕垡林場(chǎng)提供,飼養(yǎng)于溫室的指形管中。

1.2 處理方法

機(jī)械損傷:用打孔器模擬昆蟲(chóng)取食葉片的方式對(duì)合作楊的功能葉片進(jìn)行損傷,損傷大約30%的葉面積;

昆蟲(chóng)取食:實(shí)驗(yàn)前一天晚上終止楊扇舟蛾進(jìn)食,使其處于饑餓狀態(tài),第二天取8～10條健康的楊扇舟蛾幼蟲(chóng)放到合作楊葉片上取食30 min后開(kāi)始計(jì)時(shí);

在各種處理0.5,1,2,4,8 h后分別取傷害葉片和鄰近的上、下位健康葉片,立即投入液氮中冷凍,-80℃保存?zhèn)溆?。以相同條件下未損傷的合作楊植株上相同部位葉片為對(duì)照,每種處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 過(guò)氧化氫(H2O2)含量測(cè)定 參照劉俊等[8]的方法,用丙酮提取葉片中的 H2O2,萃取脫色,Ti(IV)-PAR比色法。按照同樣程序制備H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 H2O2的含量,結(jié)果以nmol/g FW表示。

1.3.2 丙二醛(MDA)含量測(cè)定 參照趙世杰等[9]的硫代巴比妥酸(TBA)法,最后采用公式MDA(μ mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450來(lái)計(jì)算MDA含量,結(jié)果以nmol/g FW表示。

1.3.3 酶活性測(cè)定 取0.2 g合作楊葉片,液氮研磨,加入1.5 ml預(yù)冷的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0),勻漿在4℃下10 000 g離心20 min,上清液立即用于酶活性測(cè)定。

SOD用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[10],以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位,以U/gFW表示。CAT采用分光光度法測(cè)定[11],以每分鐘吸光值的變化來(lái)表示酶活性大小,單位為Δ OD240/min?g FW。POD 采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[11],以每克鮮重每分鐘吸光值的變化值來(lái)表示酶活性大小,單位為△OD470/min?g FW。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用SAS軟件進(jìn)行Duncan分析,圖中不同的字母表示各處理間的差異顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 傷害脅迫對(duì)合作楊葉片MDA含量的影響

機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食處理后MDA含量隨時(shí)間的增加均有一個(gè)上升過(guò)程(圖1),機(jī)械損傷處理后MDA含量略高于其相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照,但無(wú)顯著差異。昆蟲(chóng)取食2 h后,MDA含量達(dá)到最大值,較對(duì)照增加了93.9%,隨后下降,到處理后8 h,基本恢復(fù)至對(duì)照水平。機(jī)械損傷處理后MDA含量變化趨勢(shì)與昆蟲(chóng)取食一致,但含量顯著低于昆蟲(chóng)取食。

圖1 傷害脅迫對(duì)合作楊葉片MDA含量的影響

2.2 傷害脅迫對(duì)合作楊葉片H2O2含量的影響

機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食均能誘導(dǎo)合作楊處理葉片中H2O2含量的增加,且處理間存在顯著差異(圖2)。昆蟲(chóng)取食葉片后,H2O2含量與對(duì)照相比均有顯著的增加(P＜0.05),且表現(xiàn)出同步性的特點(diǎn)。隨著昆蟲(chóng)取食時(shí)間延長(zhǎng),H2O2含量有一個(gè)升高又恢復(fù)的過(guò)程,在取食1 h后迅速升高,并在2 h時(shí)達(dá)到最大值,較對(duì)照增加了70.5%,隨后迅速下降。機(jī)械損傷處理后,H2O2含量在早期(0.5 h)升高幅度最大,之后持續(xù)下降,8 h后又有所增加。從總的趨勢(shì)來(lái)看,昆蟲(chóng)取食對(duì)H2O2積累的影響大,表明植物對(duì)不同損傷形式具有識(shí)別能力。

圖2 傷害脅迫對(duì)合作楊葉片H2O2含量的影響

2.3 合作楊葉片受損傷后抗氧化酶活性的變化

SOD、CAT和POD是植物細(xì)胞中清除活性氧的主要抗氧化酶類,機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食后,合作楊葉片中3種抗氧化酶活性均發(fā)生變化,但各有其特點(diǎn)(圖3)。機(jī)械損傷處理后,損傷葉中SOD活性迅速增加,并在1 h時(shí)達(dá)到最大值,隨后開(kāi)始下降,直至恢復(fù)到對(duì)照水平。昆蟲(chóng)取食后,SOD活性在處理初期變化比較平緩,雖有所升高,但增幅不大,到2 h時(shí)SOD活性開(kāi)始迅速上升并達(dá)到最大值,隨后迅速下降,在8 h時(shí)顯著低于對(duì)照。而葉片中CAT活性與對(duì)照相比均顯著升高,并隨時(shí)間延長(zhǎng)呈先上升再下降的趨勢(shì),在處理后2 h時(shí)CAT活性達(dá)到峰值,隨后開(kāi)始下降。昆蟲(chóng)取食后,葉片中CAT活性變化趨勢(shì)與機(jī)械損傷相似,與對(duì)照相比CAT活性變化不顯著;葉片中POD活性隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化,維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。昆蟲(chóng)取食后,葉片中POD活性在0.5 h時(shí)迅速升高達(dá)到最大值,最大增幅為70.4%,之后POD活性有所下降,但仍高于顯著高于對(duì)照。

圖3 傷害脅迫對(duì)合作楊葉片SOD,CAT,POD活性的影響

3 討論

植物在遭受到損傷時(shí),在其受傷部位會(huì)發(fā)生一系列的早期信號(hào)事件,ROS的產(chǎn)生是早期信號(hào)事件之一。當(dāng)ROS積累超過(guò)抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí),ROS就會(huì)大量積累,造成了抗氧化酶活性的降低和膜透性的增加[12-13]。MDA是膜質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一,其積累是自由基毒害作用的表現(xiàn)。因此,MDA可以代表細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化水平和生物膜損傷程度的大小,目前已成為判斷膜質(zhì)過(guò)氧化作用的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果表明,昆蟲(chóng)取食后,H2O2含量與對(duì)照相比均有顯著的增加,且在取食1 h后迅速升高,并在2 h時(shí)達(dá)到最大值,隨后迅速下降(圖 2);與之相應(yīng)的,MDA含量也呈先上升后下降趨勢(shì),并在取食2 h后達(dá)到最大值,隨后下降,直至恢復(fù)至對(duì)照水平(圖1)。機(jī)械損傷處理后MDA含量變化趨勢(shì)與昆蟲(chóng)取食一致,但含量顯著低于昆蟲(chóng)取食;H2O2含量在早期(0.5 h)升高幅度最大,之后持續(xù)下降,8 h后又有所增加。表明機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食均在一定程度上引起合作楊葉片膜質(zhì)過(guò)氧化。

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中自身形成了多種機(jī)制可以清除活性氧,其中SOD、CAT和POD等抗氧化酶類在植物體內(nèi)協(xié)同作用清除過(guò)量的活性氧,SOD可抑制膜質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的積累,保持和修復(fù)細(xì)胞膜;POD可把SOD等產(chǎn)生的H2O2變成H2O,使活性氧維持在較低水平上;CAT可與SOD偶聯(lián),徹底清除體內(nèi)超氧陰離子及H2O2等氧自由基。這些抗氧化酶類在維持活性氧的代謝平衡、保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中起重要作用,從而使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵御逆境脅迫傷害[15]。

在本研究中,傷害脅迫后合作楊葉片內(nèi)各種保護(hù)酶活性均受到不同程度的影響,其變化方式因不同損傷形式而異(圖3)。從總體趨勢(shì)來(lái)看,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),抗氧化酶活性(SOD、CAT和POD)呈先升高后下降的變化規(guī)律,表明了它們抗傷害脅迫的協(xié)同性,共同組成防御過(guò)氧化系統(tǒng),抵抗不良條件對(duì)植物體的破壞。昆蟲(chóng)取食后,SOD和POD活性隨時(shí)間的增加而增加,分別在1 h和2 h時(shí)達(dá)到最大值,隨后開(kāi)始下降;CAT活性也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì),但與對(duì)照相比無(wú)顯著變化。機(jī)械損傷處理后,合作楊葉片中的SOD和CAT活性隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),在處理末期其活性仍然顯著高于對(duì)照;而POD活性隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)明顯變化,維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。這些酶活性變化與昆蟲(chóng)取食和機(jī)械損傷后葉片內(nèi)MDA和H2O2積累表現(xiàn)出一致性,從而有效清除ROS,維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定。兩種不同處理方法中,昆蟲(chóng)取食誘導(dǎo)的膜質(zhì)過(guò)氧化和抗氧化酶活性變化與機(jī)械損傷誘導(dǎo)結(jié)果表現(xiàn)出明顯差異,這是因?yàn)槔ハx(chóng)取食除了對(duì)合作楊葉片造成機(jī)械損傷,同時(shí)還有其口腔分泌物的參與。表明合作楊遭到傷害脅迫后體內(nèi)H2O2短時(shí)間內(nèi)快速積累可能與抗蟲(chóng)性之間存在著一定關(guān)聯(lián)。

綜上所述,機(jī)械損傷和昆蟲(chóng)取食均能引起合作楊葉片中活性氧迸發(fā),同時(shí)又通過(guò)誘導(dǎo)抗氧化酶類活性提高,降低膜質(zhì)過(guò)氧化水平,進(jìn)一步誘導(dǎo)傷害防御反應(yīng)產(chǎn)生,為探討合作楊抗蟲(chóng)性機(jī)制從生理生化方面奠定了基礎(chǔ)。

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