嗅三針對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬ET和CGRP含量的影響

楊曉航 ，劉智斌 *，牛文民 ，王 淵

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，陜西 咸陽 712046）

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是由腦血管疾病因素導(dǎo)致腦組織損害而引起的癡呆綜合征，是唯一可以有效預(yù)防和治療的老年期癡呆病。眾多研究資料表明，腦組織血管舒縮因素平衡失調(diào)是VD的重要病理機(jī)制[1]。筆者依據(jù)多年來治療VD的經(jīng)驗(yàn)[2-3]，選擇VD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究嗅三針（兩側(cè)“迎香”及“印堂”穴）對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬內(nèi)皮素（endothelin，ET）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）含量的影響?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 成年Sprague Dawley雄性大鼠40只，體質(zhì)量（300±10）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物編號(hào)：0001450）。

1.1.2 儀器 SDQ-30雙極射頻電凝器（上海手術(shù)器械廠出品）；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) （北京現(xiàn)代太極電子有限公司出品）；SN-695B型放射免疫測(cè)量?jī)x （上海核儀器一廠出品）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 VD大鼠動(dòng)物模型 按照經(jīng)典的四血管阻斷（4-Vesselocclusion,4-VO）方法制作血管性癡呆模型[4]。用10%水合氯醛（0.4 mL/100 g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)無菌操作。頸部背側(cè)后正中切口，暴露第一頸椎橫突孔，電凝燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈，造成永久性閉塞。24 h后，頸部腹側(cè)前正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用微動(dòng)脈夾可逆性夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min,共夾閉3次，每次間隔1 h。手術(shù)部位施以適量青霉素抗感染，仔細(xì)縫合，常規(guī)飼養(yǎng)。VD嗅球損毀大鼠動(dòng)物模型 參照陳志蓉報(bào)道的損毀大鼠嗅球的方法[5]，將VD造模成功的大鼠用水合氯醛麻醉后，固定在立體定位儀上。在大鼠顱頂正中切開皮膚，小范圍分離暴露前囟。在大鼠顱頂正中線位于前囟前面5 mm兩側(cè)旁開2 mm處，分別鉆2個(gè)直徑為1 mm的小孔。將HS-80型電烙鐵的烙頭插入顱內(nèi)，電凝損毀雙側(cè)嗅球。

1.2.2 動(dòng)物分組 隨機(jī)分為4組，即正常組、VD模型組（大鼠造VD動(dòng)物模型）、VD嗅球損毀模型組 （大鼠造VD動(dòng)物模型及嗅球損毀并行嗅三針治療）、嗅三針組（大鼠造VD動(dòng)物模型并行嗅三針治療），每組10只。

1.2.3 嗅三針的定位與操作 嗅三針穴定位為兩側(cè)迎香及印堂穴。依據(jù)李忠仁教授主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》動(dòng)物選穴標(biāo)準(zhǔn)[6]，“迎香”穴：大鼠鼻孔外側(cè)上端，有毛與無毛交界處；“印堂”穴：大鼠兩眼眶上緣中點(diǎn)連線與正中線交點(diǎn)。操作：選用“華佗牌”不銹鋼針，30號(hào)0.5寸毫針。迎香穴向內(nèi)上方斜刺0.3 cm，印堂穴向鼻根部平刺0.3 cm。G6805電針儀，上海醫(yī)療儀器廠出品；刺激參數(shù)：疏密波，刺激強(qiáng)度以保持針刺局部輕微抖動(dòng)為度 （電流強(qiáng)度：1～3 mA，電壓：1～3 V）。 留針 10 min，持續(xù)電刺激，每日 1次。5 d為1個(gè)療程，休息2 d，共進(jìn)行6個(gè)療程。從VD模型組和VD嗅球損毀模型組造模完成當(dāng)日起，正常組和VD模型組每日1次采取與嗅三針治療相同的捉拿固定，但不實(shí)施針刺干預(yù)，正常飲食飼養(yǎng)42 d；VD嗅球損毀模型組及嗅三針組均采用嗅三針治療42 d。

1.2.4 Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)[7]治療結(jié)束后第1天，開始水迷宮測(cè)試。水迷宮內(nèi)水深41 cm，水溫22～26℃。在水池壁標(biāo)明4個(gè)入水點(diǎn)，由此將水池等分為4個(gè)象限，任選一象限正中放置平臺(tái)，沒于水下1 cm，水面覆蓋塑料泡沫。將受試大鼠按順時(shí)針方向依次由E、S、W、N 4個(gè)入水點(diǎn)順序面向池壁放入水中。記錄2 min內(nèi)尋找平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2 min內(nèi)找到平臺(tái)，記錄其實(shí)際逃避潛伏期及游泳路程；如果大鼠在2 min內(nèi)未找到平臺(tái)，由測(cè)試者將其引上平臺(tái)并停留10 s,逃避潛伏期記錄為2 min。歷時(shí)3 d,每日1次。用3 d找到平臺(tái)的平均逃避潛伏期和平均游泳路程評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.5 海馬ET和CGRP含量測(cè)定 水迷宮實(shí)驗(yàn)3 d結(jié)束后，各組大鼠斷頭后快速取出全腦，在冰盒上分離海馬。用冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干附著的液體后，稱質(zhì)量后加入0.1 mol/L HAC 2mL，100℃水浴中煮沸10 min。充分勻漿后倒入塑料指形管中，4℃離心 （3 000 r/min，20 min），取上清液置于-20℃冰箱內(nèi)保存待檢測(cè)。海馬ET和CGRP含量測(cè)定采用放射免疫法，試劑盒購自南京建成生物工程研究院，按照藥盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 11.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“±s”表示，采用單因素方差分析、組間均值進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 嗅三針對(duì)大鼠Morris水迷宮定位航行的影響

各組大鼠嗅三針治療后，與正常對(duì)照組比較，VD模型組3 d平均逃避潛伏期和平均游泳路程均延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與VD模型組比較，嗅三針組3 d平均逃避潛伏期和平均游泳路程均縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與VD模型組比較，嗅三針對(duì)VD嗅球損毀模型3 d平均逃避潛伏期和平均游泳路程無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 嗅三針對(duì)大鼠Morris水迷宮定位航行的影響 （n=10，±s）

表1 嗅三針對(duì)大鼠Morris水迷宮定位航行的影響 （n=10，±s）

注：與正常對(duì)照組比較▲P<0.01；與VD模型組比較*P>0.05，**P<0.01；與VD嗅球損毀模型組比較△P<0.01。下同。

組 別正常對(duì)照組VD模型組VD嗅球損毀模型組嗅三針組平均逃避潛伏期（s）平均游泳路程（cm）14.56±7.15 102.56±17.12 112.68±14.53▲ 155.68±16.53▲121.18±15.12* 163.15±15.11*64.16±12.18**△ 114.16±12.28**△

2.2 嗅三針對(duì)大鼠海馬ET和CGRP含量的影響

與正常對(duì)照組比較，VD模型組海馬ET含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與VD模型組及VD嗅球損毀模型組比較，嗅三針組海馬ET含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，VD模型組海馬CGRP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與VD模型組及VD嗅球損毀模型組比較，嗅三針組海馬CGRP含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VD模型組與VD嗅球損毀模型組比較，嗅三針對(duì)海馬ET、CGRP含量均無影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

3 討論

血管性癡呆（Vascular Dementia,VD）屬于中醫(yī)學(xué)“善忘”、“呆病”、“癡證”等范疇。依據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，VD是由于心腦血管病變，因缺血性或出血性腦組織損害所導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙，是老年癡呆的常見類型。研究結(jié)果表明，腦組織血管舒縮因素平衡失調(diào)是VD的重要病理機(jī)制[1]。

表2 嗅三針對(duì)大鼠海馬ET和CGRP含量的影響 （n=10，±s）

表2 嗅三針對(duì)大鼠海馬ET和CGRP含量的影響 （n=10，±s）

組 別正常對(duì)照組VD模型組VD嗅球損毀模型組嗅三針組ET（pg/mg）CGRP（pg/mg）18.72±4.72 785.36±46.96 32.11±5.78▲ 668.48±41.33▲35.15±4.56* 683.85±42.16*24.36±2.62**△ 732.12±47.12**△

ET和CGRP是機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管和舒血管多肽，對(duì)腦組織血液循環(huán)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究表明，VD患者的腦組織中ET含量增高、同時(shí)CGRP含量降低。ET可引發(fā)過氧化反應(yīng)、促進(jìn)興奮性氨基酸釋放，從而加劇腦組織缺血性損害。相反地，CGRP卻具有增加腦血流量和神經(jīng)保護(hù)的雙重作用[8-9]。本研究結(jié)果顯示，嗅三針能夠明顯增強(qiáng)VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并且能降低VD模型大鼠海馬ET含量同時(shí)提高CGRP含量。然而，對(duì)于VD損毀嗅球模型大鼠，嗅三針未能增強(qiáng)其學(xué)習(xí)記憶能力也沒有明顯影響海馬ET和CGRP的含量。這表明嗅三針對(duì)于VD大鼠的療效是通過嗅覺傳導(dǎo)路對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生作用的，這與筆者前期的研究結(jié)果相一致[2]。

本研究證實(shí)了嗅三針對(duì)VD的治療作用是確切的，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)海馬ET和CGRP含量密切相關(guān)，其療效的發(fā)揮有賴于嗅覺傳導(dǎo)路的完整性。

[1]胡 蓉，嚴(yán) 潔，李鐵浪.電針不同穴位對(duì)腦缺血大鼠血漿和腦組織內(nèi)皮素、降鈣素基因相關(guān)肽含量的影響[J].針刺研究，2008，33（3）：169-172.

[2]劉智斌，牛文民，楊曉航，等.嗅三針治療血管性癡呆的隨機(jī)對(duì)照研究[J].針刺研究，2008，33（2）：131-134.

[3]劉智斌，牛文民，楊曉航，等.頭部發(fā)際區(qū)排針法治療血管性癡呆療效觀察[J].中國針灸，2007，27（6）：412-414

[4]賴新生，王 黎，江雪華.電針對(duì)實(shí)驗(yàn)性血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶及 SOD 和 MDA 的影響[J].中國針灸，2000，20（8）：497-500.

[5]陳志蓉.貫葉連翹提取物對(duì)大鼠雙側(cè)嗅球損毀模型的行為學(xué)影響[J].中國藥學(xué)雜志，2004，39（9）：663-666.

[6]李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2004：327-329.

[7]Morris R G.Place navigation impared in rats with hippocampal lessens[J].Nature,1982，297（5 868）：681-682.

[8]Yanagisawa M,Kuceihara H,Kinura S1A novel potent vasoconstrictor peptide by vascular endothelial cells[J].Nature,1988，332（6 163）：411-415.

[9]花 放，方秀斌，張 璐.降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠全腦缺血再灌注腦組織的保護(hù)作用[J].卒中與神經(jīng)疾病，2002，9（6）：331-334.