舊院黑雞致病性大腸桿菌的分離與藥敏試驗

何 博

（四川省達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院經(jīng)濟(jì)管理系，四川 達(dá)州 635001）

2009年10月初，我校附近一小型養(yǎng)雞戶養(yǎng)殖的舊院黑雞發(fā)病，并有死亡。通過臨床癥狀，病理剖檢初步診斷為舊院黑雞大腸桿菌病。從現(xiàn)場采集了病料，通過病原分離、生化培養(yǎng)等試驗，最終確定病原體為禽致病性大腸桿菌。分離的大腸桿菌用臨床常用抗生素進(jìn)行了藥敏試驗，根據(jù)藥敏結(jié)果合理選擇藥物，有效地控制了該雞場的病情?，F(xiàn)報道如下：

1 材料

1.1 病料來源 無菌采集自發(fā)病養(yǎng)殖場患病死亡的舊院黑雞的肝臟和心血。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂斜面、麥康凱瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面等，所有培養(yǎng)基均按照文獻(xiàn)[1]自行配制；細(xì)菌生化鑒定管：腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)微量鑒定管（11種×15支/盒），杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；試劑：細(xì)菌生化微量試驗試劑盒（10mL×10種），杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；革蘭氏染液、麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管等自行準(zhǔn)備。

1.3 藥敏紙片 氨芐西林、氨芐西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢噻吩、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、鏈霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素等11種藥敏紙片由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；氟苯尼考藥敏紙片按文獻(xiàn)[2]自行制作。

1.4 主要試驗設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、分光光度計、pH計、電爐、冰箱等。

1.5 試驗動物 健康小白鼠10只，體重18～22g/只。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無菌采集病死雞的肝臟、心血，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h，然后挑取單個菌落接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h，再選取平板中單個典型菌落接種于營養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)18～24h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)菌的染色鏡檢 用滅菌接種環(huán)挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上的菌落制成涂片，革蘭氏染色后鏡檢。

2.3 生化試驗 挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上的菌落接種到三糖鐵培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長特征。參照生化鑒定管使用說明書，挑取營養(yǎng)瓊脂斜面上的單個菌落接種于腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)微量鑒定管內(nèi)，37℃培養(yǎng)，按規(guī)定時間對菌株的生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判斷。

2.4 動物試驗 取細(xì)菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用滅菌生理鹽水無菌洗下制成細(xì)菌懸液，將菌懸液的濃度用生理鹽水調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?xì)菌數(shù)約為1.5×108CFU/mL）待用。將10只小白鼠隨機(jī)平均分成2組，每組5只，第1組每只小白鼠腹腔注射菌懸液0.2mL；第2組腹腔注射無菌生理鹽水0.2mL作對照。隔離飼養(yǎng)，觀察小白鼠的發(fā)病死亡情況。小白鼠死亡后剖檢，將病變組織接種于麥康凱培養(yǎng)基上，挑取可疑菌落鏡檢、生化鑒定。

2.5 藥敏試驗 按“紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行藥敏試驗。用一無菌棉拭子蘸取校正為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，在管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液，均勻涂布于整個瓊脂平板表面。等平板上的菌液稍干后，將藥敏片依次均勻貼放到平板上。各紙片中心相距約24mm，紙片距平板邊緣約15mm，各紙片間距離相等。將平板倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)16～18h，然后觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性 經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24 h后，該病料菌株在營養(yǎng)培養(yǎng)基上生長良好，形成一種圓形凸突、光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明、中等大小的灰白色菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成直徑1～2mm左右、光滑濕潤的紅色菌落；在三糖鐵瓊脂斜面中，斜面變黃，管底變黃、產(chǎn)氣，無H2S產(chǎn)生。

3.2 染色鏡檢結(jié)果 細(xì)菌涂片經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢，可見：陰性小桿菌，兩端鈍圓，散在或成對存在。

3.3 生化試驗結(jié)果 分離菌株的生化試驗結(jié)果見表1。分離菌株的生化特性完全符合大腸桿菌的特征。綜合培養(yǎng)特征、鏡檢特征、生化試驗結(jié)果，可鑒定此分離菌株為大腸桿菌。

表1 分離菌株的生化試驗結(jié)果

3.4 動物試驗結(jié)果 小白鼠在細(xì)菌接種后24～48h內(nèi)全部死亡。剖檢死亡小白鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟腫脹出血，心外膜出血，從死亡小白鼠的肝臟和心血中，分離得到與原分離菌株一致的革蘭氏陰性桿菌。對照組無異常表現(xiàn)。這說明分離菌株為致病性大腸桿菌。

3.5 藥敏試驗結(jié)果 將分離的菌株與氨芐西林、環(huán)丙沙星等12種常用抗菌藥進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明菌株對其中的3種敏感，3種中敏，6種耐藥。結(jié)果見表2。

表2 藥敏試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果

4 小結(jié)與討論

4.1 根據(jù)分離菌株的培養(yǎng)特性、染色特性、生化試驗及動物試驗結(jié)果，鑒定分離菌為致病性大腸桿菌。雞的大腸桿菌病是由大腸桿菌某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱，本病一年四季均可發(fā)生，各個品種和日齡的雞均可發(fā)病，但雛雞最易感，雛雞發(fā)病率可達(dá)30%～60%，病死率可達(dá)100%。

4.2 大腸桿菌是革蘭氏陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌，由于近年來抗菌藥物使用頻率和使用量的增加，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株和耐藥能力都不斷增加。本次藥敏試驗結(jié)果也表明，曾對大腸桿菌敏感的廣譜青霉素類、頭孢菌素類、喹諾酮類抗菌藥隨著臨床的廣泛應(yīng)用而產(chǎn)生了不同程度的耐藥。

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇高敏藥物——氟苯尼考的可溶性粉劑對全場雞混飲（100mg/L）給藥，每天2次，每次2h，連續(xù)使用4d，同時加強(qiáng)對飼喂用具及雞舍環(huán)境的衛(wèi)生消毒，可以有效地控制雞只死亡，使雞群逐步恢復(fù)健康。

4.3 大腸桿菌是一種普遍存在的腸道常在菌群，防治本病的關(guān)鍵是：加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、消除各種應(yīng)激因素，增強(qiáng)雞只的抵抗力；加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理，做好各個養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的衛(wèi)生消毒，控制大腸桿菌的大量繁殖。

4.4 為了有效防治大腸桿菌病，也為了減少畜產(chǎn)品中抗菌藥物的殘留，在臨床用藥時應(yīng)注意：避免采用抗菌藥低劑量長期預(yù)防用藥，可選用無毒性、無殘留的微生態(tài)制劑或有效的大腸桿菌疫苗進(jìn)行日常預(yù)防；為了增加治療的針對性，最好使用經(jīng)藥敏試驗篩選的敏感性藥物進(jìn)行治療，病愈后應(yīng)及時停藥；加大開發(fā)有效的滅活酶抑制劑、外輸泵抑制劑、耐藥質(zhì)粒消除劑、抗菌藥物增強(qiáng)劑等，和抗菌藥物聯(lián)合使用，提高藥物的敏感性，降低使用劑量；加強(qiáng)開發(fā)對大腸桿菌有抑制作用的中草藥制劑，發(fā)揮其低毒性、無殘留、不產(chǎn)生耐藥的優(yōu)點。

[1]甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)主編.獸醫(yī)微生物學(xué)試驗指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1991.

[2]周喜翠.簡易藥敏紙片的制作和應(yīng)用 [J].北方牧業(yè)，2005，23：27.

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)[S].WS/T 125-1999.

[4]甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)主編.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994：212-217.

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