參附注射液對β淀粉樣蛋白所致阿爾茨海默病大鼠認知行為和腦組織氧化應激的影響

李桂瓊,柯大智

(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院老年病科 400010)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一類以進行性認知障礙和記憶力損傷為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,主要病理改變包括皮質(zhì)神經(jīng)元脫失、腦組織內(nèi)老年斑和神經(jīng)元內(nèi)纖維纏結(jié)形成。隨著人口老齡化,該病已成為威脅老年人生活質(zhì)量的主要疾病之一,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。AD的病因尚未闡明,仍然沒有特效的治療藥物。

現(xiàn)有的研究表明,腦組織的氧化應激反應參與了AD的發(fā)生和發(fā)展[1-4]。參附注射液是紅參、黑附片提取物的制劑,能增強心肌收縮力、增加心輸出量(CO)、舒張冠狀動脈及增加腦血流量。因此,臨床上將SF作為治療心力衰竭、休克、心肌梗死及腫瘤放療、化療的輔助用藥,均取得了良好的療效。同時,研究發(fā)現(xiàn),參附注射液中的某些有效成分可以減輕腦組織的氧化應激,從而抑制神經(jīng)元的損傷[5-6]?；诖?本研究采用β淀粉樣蛋白(Aβ)側(cè)腦室注射,觀察其對AD大鼠認知行為及腦組織氧化應激的影響,探討其對AD的療效及其可能的作用機制,為SF臨床治療AD提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠30只(第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,SPF級),雌雄各半,體重(250±38)g,分籠飼養(yǎng)(10只/籠),自由攝食水。適應性喂養(yǎng)1周后,然后行水迷宮訓練,訓練動物學會迷宮為止。

1.1.2 藥物與試劑 參附注射液(雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準字Z20043116);Aβ(Sigma公司生產(chǎn))以蒸餾水溶解后保存于-20℃,避免反復凍融。臨用前配成濃度為2μ g/μ L。SOD、GSH-PX、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。具體檢測方法:SOD活力測定采用NBT法,其中每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個活力單位;GSH-PX活力測定測定采用DTNB法;MDA含量采用硫代巴比妥酸法檢測。

1.1.3 主要儀器 RD1101-M型Morris水迷宮(上海移數(shù)信息科技有限公司生產(chǎn));MP8000系列腦立體定位儀(深圳市瑞沃德科技有限公司生產(chǎn));752型紫外可見分光光度計(南京第四分析儀器有限公司生產(chǎn));3-18K型高速低溫冷凍離心機(Sigma公司生產(chǎn),Germany)。

1.2 水迷宮訓練 水迷宮測試的原理:在定位航行試驗中,AD大鼠潛伏期延長,單位時間內(nèi)跨越原平臺次數(shù)減少,表明其空間記憶力受損。以直徑1.3m,高 50cm,水深30cm,水溫(20±2)℃的水迷宮東、西、南、北4點為標記,將水迷宮分為4個象限。在東南象限正中放置一個透明平臺,高約35cm,將其位置固定。以正西方向標記點為起步區(qū),手提大鼠尾根部,從起步區(qū)將大鼠放入迷宮中,訓練中每次大鼠游上平臺后,讓其在平臺上休息60s以強化記憶。以連續(xù)4次大鼠在60s內(nèi)游上平臺作為大鼠學會迷宮的標準,給藥2周后記錄大鼠在水迷宮中潛伏期值。

1.3 分組及給藥 AD大鼠模型的建立參見張文珺等[7]實驗方法,具體如下:實驗大鼠20%的烏拉坦(1.0g/kg)腹腔注射麻醉大鼠,麻醉后固定于腦立體定位儀上。顱頂正中矢狀切開,行立體定位(前囟后3.5mm,中線旁開2.2mm,顱骨表面下3.1mm)。造模:正常對照組:用微量進樣器吸取 DW 5μ L,緩慢注入側(cè)腦室。Aβ組和Aβ+SF組:微量進樣器吸取 Aβ 5μ L,緩慢注入側(cè)腦室。注射結(jié)束后消毒局部注射部位皮膚,縫合皮膚,保溫促其蘇醒,正常喂養(yǎng)。Aβ+SF組SF腹腔注射,采用10mL/kg作為使用劑量,每日1次。正常對照組和Aβ組用等量生理鹽水(NS)替代,連續(xù)14d,每日1次。術(shù)后給藥2周,再次進行水迷宮測試,記錄各組大鼠從起步區(qū)入水迷宮后到游上平臺的時間,即為潛伏期。

1.4 組織取材及氧化應激指標測定 待給藥2周水迷宮測試后2h,斷頸處死大鼠,迅速取腦組織分離出海馬和皮質(zhì),使用玻璃勻漿器在冰浴中制成10%的組織勻漿。而后將組織勻漿液以3 000r/min離心10min,取上清液按試劑盒說明處理,752可見光分光光度計比色法測定SOD、GSH-PX活力以及MDA的含量。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般情況 觀察動物精神、意識、行為、進食、進水等情況。造模前各組動物均反應良好。造模后,起初興奮不安,隨后出現(xiàn)反應遲鈍、行動緩慢、嗜臥、飲食及飲水減少等。模型組還存在體重減輕、毛發(fā)干枯等現(xiàn)象。給予SF后,上述癥狀均有不同程度改善。

2.2 水迷宮檢測大鼠行為學改變 相對于正常對照組(水迷宮潛伏期值:5.923±1.842),兩周后模型組(Aβ組:24.368±5.759;Aβ+SF組:20.311±3.236)大鼠水迷宮潛伏期明顯延長,表明Aβ所致AD模型建模成功;相對于模型對照組,Aβ+SF注射組可明顯改善大鼠記憶力,縮短大鼠水迷宮潛伏期,且與模型組存在著差異,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠皮質(zhì)區(qū)相關自由基活力與水平 相對于模型對照組,SF可明顯升高大鼠皮質(zhì)勻漿中SOD、GSH-PX活力(P＜0.05),降低 MDA在皮質(zhì)中蓄積量(P＜0.05)。表明 SF能明顯增加大鼠皮質(zhì)中SOD、GSH-PX的活力、減少M DA蓄積,從而減輕Aβ所致的氧化應激反應。見表1。

2.4 各組大鼠海馬區(qū)相關氧自由基活力與水平 相對于模型對照組,SF同樣可有效升高大鼠海馬勻漿中SOD、GSH-PX活力(P＜0.05),降低MDA在海馬區(qū)中蓄積量(P＜0.05)。表明SF同樣能顯著增加大鼠滑海馬SOD、GSH-PX的活力、減少MDA的蓄積。見表2。

表1 各組大鼠皮質(zhì)SOD、GSH-PX活力及MDA含量,n=10)

表1 各組大鼠皮質(zhì)SOD、GSH-PX活力及MDA含量,n=10)

與NS組比較,*:P＜0.05,**:P＜0.01;與Aβ組比較,#:P＜0.05。

組別 n SOD活力(NU/mg)GSH-PX活力(NU/mg)MDA含量(nmol/mg)NS組 10 55.386±13.741 20.432±5.266 2.810±0.803 Aβ組 10 16.543±4.427** 11.975±3.101**4.833±1.008*Aβ+SF 組 10 21.039±5.101**#15.305±4.624*#3.729±0.896*#

表2 各組大鼠海馬SOD、GSH-px活力及MDA含量,n=10)

表2 各組大鼠海馬SOD、GSH-px活力及MDA含量,n=10)

與NS組比較,*:P＜0.05,**:P＜0.01;與Aβ組比較,#:P＜0.05。

組別 n SOD活力(NU/mg)GSH-PX活力(NU/mg)MDA含量(nmol/mg)NS組 10 33.461±10.089 18.665±4.378 2.039±0.571 Aβ組 10 23.227±5.143** 10.994±3.585**4.442±0.992*Aβ+SF 組 10 28.254±6.793*# 13.305±4.067*#3.218±0.835*#

3 討 論

大量的研究證實,Aβ因其神經(jīng)細胞毒性及在腦組織中的聚集,在AD的發(fā)病中占有十分重要的作用[8-11]。Korshunova等[12]研究發(fā)現(xiàn),注射Aβ蛋白可導致記憶力損傷。在Aβ寡聚體的研究中,Watanabe等[13-14]發(fā)現(xiàn),AD時Aβ寡聚體合并腦缺血可引起非凋亡性記憶力損傷,而該損傷與乙酰膽堿釋放減少有關。有報道指出,在AD發(fā)生、發(fā)展過程中 Aβ與氧化應激關系密切[15-17]。氧化應激反應可以激活Aβ前體蛋白γ-分泌酶和β-分泌酶分裂的正反饋調(diào)節(jié),從而促進Aβ蛋白的合成[18]。而Aβ蛋白可通過氧化應激的誘導從而引起鈣調(diào)磷酸酶(依賴于鈣調(diào)蛋白的絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶)的下調(diào)[16]。氧化應激和Aβ蛋白共同作用可導致大鼠神經(jīng)元死亡、淀粉樣沉積、黑質(zhì)和記憶力的損傷[17]。同時,對于AD發(fā)病機制的研究,人們普遍認為腦內(nèi)慢性炎癥可能是其重要病理特征之一,從而提出了AD的相關炎癥機制。

參附注射液的主要活力成分包括人參皂苷和烏頭生物堿類,具有直接清除自由基和過氧化物,提高組織細胞的耐低氧和抗應激能力,可有效減輕腦缺血時的組織細胞損傷和再灌注損傷,同時降低血液黏度,減少血小板聚集而減輕腦缺血的發(fā)展。其強心、升壓、穩(wěn)壓作用,可保證腦部灌注,同時能改善腦細胞對葡萄糖和氧的攝取,促進ATP的合成,改善病變組織的細胞能量狀態(tài),有利于神經(jīng)功能的改善以及智能的恢復。鑒于此,在本研究中采用Aβ蛋白側(cè)腦室注射復制AD大鼠模型,隨后使用臨床上廣泛運用的參附注射液作用于AD大鼠,觀察其對AD大鼠記憶力及氧化應激相關因子的影響。

研究表明,參附注射液中的有效成分之一人參皂苷Rg1可有效減輕Aβ短肽(25-35)所誘導的AD小鼠的學習和記憶力損傷[19]。在隨后的研究中,Chen等[6]也發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1可通過抑制氧化應激而減輕AD小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷。在人參皂苷Rd中也發(fā)現(xiàn),Rd可減輕衰老小鼠腦組織的氧化應激[20]。

正常情況下,機體的抗氧化能力與氧化能力之間保持著動態(tài)平衡。若自由基產(chǎn)生過多或抗氧化能力下降,將導致機體損傷。大量氧自由基的產(chǎn)生可直接損傷線粒體、溶酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等,同時還可損傷細胞DNA等結(jié)構(gòu),促進某些疾病的發(fā)生、發(fā)展。而體內(nèi)的SOD、GSH-PX則可有效地清除自由基,減輕組織損傷。SOD與GSH-PX協(xié)同作用清除機體過多的自由基及有機過氧化物[21-22]。而脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物如M DA可與DNA、RNA、蛋白質(zhì)、磷脂等物質(zhì)結(jié)合,損傷細胞膜,引起神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,同時其細胞毒性作用是導致AD神經(jīng)元變性壞死的重要原因[23]。

在本研究中,觀察到相類似的現(xiàn)象,即參附注射液明顯縮短大鼠迷宮潛伏期,改善AD大鼠記憶力;在檢測相關氧自由基水平時,作者發(fā)現(xiàn)參附注射液可效增強SOD和GSH-PX的活力,減少有毒物質(zhì)MDA在腦組織中的蓄積,從而減輕腦組織中氧化應激反應,保護皮質(zhì)、海馬的神經(jīng)元,進而恢復AD大鼠的記憶力和認知力,達到改善AD動物記憶力的目的。

事實上,參附注射液是通過直接抑制氧化應激中相關自由基,還是通過某些信號途徑降低Aβ所誘導的AD中的氧自由基水平,尚不是很清楚,這值得進一步研究。

[1]Cenini G,Sultana R,Memo M,et al.Effects of oxidative and nitrosative stress in brain on p53 proapoptotic protein in amnestic mild cognitive impairment and Alzheimer disease[J].Free Radic Biol Med,2008,45(1):81.

[2]Resende R,Moreira PI,Proenca T,et al.Brain oxidative stress in a triple-transgenic mouse model of Alzheimer disease[J].Free Radic Biol Med,2008,44(12):2051.

[3]Gackowski D,Rozalski R,Siomek A,et al.Oxidative stress andoxidative DNA damage is characteristic for mixed Alzheimer disease/vascular dementia[J].J Neurol Sci,2008,266(1-2):57.

[4]Pratic ò D.Evidence of oxidative stress in Alzheimer′s disease brain and antioxidant therapy:lights and shadows[J].Ann N Y Acad Sci,2008,1147:70.

[5]Fu Y,Ji LL.Chronic ginseng consumption attenuates ageassociated oxidative stress in rats[J].J Nutr,2003,133(11):3603.

[6]Chen XC,Zhou YC,Chen Y,et al.Ginsenoside Rg1 reduces MPTP-induced substantia nigra neuron loss by suppressing oxidative stress[J].Acta Pharmacol Sin,2005,26(1):56.

[7]張文珺,楊金霞,商秀麗.緩激肽對β淀粉樣蛋白所致阿爾茨海默病動物模型行為學及形態(tài)學的影響[J].中國醫(yī)科大學學報,2008,37(4):455.

[8]Roychaudhuri R,Yang M,Hoshi MM,et al.Amyloid beta-protein assembly and Alzheimer disease[J].J Biol Chem,2009,284(8):4749.

[9]Yankner BA,Lu T.Amyloid beta-protein toxicity and the pathogenesis of Alzheimer disease[J].J Biol Chem,2009,284(8):4755.

[10]Zaghi J,Goldenson B,Inayathullah M,et al.Alzheimer disease macrophages shuttle amyloid-beta from neurons to vessels,contributing to amyloid angiopathy[J].Acta Neuropathol,2009,117(2):111.

[11]方傳勤,周華東.β淀粉樣蛋白免疫治療阿爾茨海默病的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2007,36(1):78.

[12]Korshunova TA,Bravarenko NI,Balaban PM.Impairment of Context Memory by beta-Amyloid Peptide in Terrestrial Snail[J].Front Behav Neurosci,2008,2:3.

[13]Watanabe T,Yamagata N,Takasaki K,et al.Decreased acetylcholine release is correlated to memory impairment in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer′s disease[J].Brain Res,2009,1249:222.

[14]Watanabe T,Iwasaki K,Ishikane S,et al.Spatial memory impairment without apoptosis induced by the combination of beta-amyloid oligomers and cerebral ischemia is related to decreased acetylcholine release in rats[J].J Pharmacol Sci,2008,106(1):84.

[15]Ferrera P,Mercado-Gó mez O,Silva-Aguilar M,et al.Cholesterol potentiates beta-amyloid-induced toxicity in human neuroblastoma cells:involvement of oxidative stress[J].Neurochem Res,2008,33(8):1509.

[16]Celsi F,Svedberg M,Unger C,et al.Beta-amyloid causes downregulation of calcineurin in neurons through induction of oxidative stress[J].Neurobiol Dis,2007,26(2):342.

[17]Lecanu L,Greeson J,Papadopoulos V.Beta-amyloid and oxidative stress jointly induce neuronal death,amyloid deposits,gliosis,and memory impairment in the rat brain[J].Pharmacology,2006,76(1):19.

[18]Tamagno E,Guglielmotto M,Aragno M,et al.Oxidative stress activates a positive feedback between the gammaand beta-secretase cleavages of the beta-amyloid precursor protein[J].J Neurochem,2008,104(3):683.

[19]Wang XY,Chen J,Zhang JT.Effect of ginsenoside Rg1 on learning and memory impairment induced by beta-amyloid peptide(25-35)and its mechanism of action[J].Yao Xue Xue Bao,2001,36(1):1.

[20]Yokozawa T,Satoh A,Cho EJ.Ginsenoside-Rd attenuates oxidative damage related to aging in senescence-accelerated mice[J].J Pharm Pharmacol,2004,56(1):107.

[21]Petrik MS,Wilson JM,Grant SC,et al.Magnetic resonance microscopy and immunohistochemistry of the CNS of the mutant SOD murine model of ALS reveals widespread neural deficits[J].Neuromolecular Med,2007,9(3):216.

[22]Lin T,Yang MS.Benzo[a]pyrene-induced elevation of GSH level protects against oxidative stress and enhances xenobiotic detoxification in human HepG2 cells[J].Toxicology,2007,235(1-2):1.

[23]Kowalczuk K,Stryjecka-Zimmer M.The influence of oxidative stress on the level of malondialdehyde(MDA)in different areas of the rabbit brain[J].Ann Univ Mariae Curie Sklodowska,2002,57(2):160.