5種經(jīng)典耐藥基因在兒童常見(jiàn)惡性腫瘤的表達(dá)及臨床意義*

向 麗,金先慶

(重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院普外科 400014)

惡性腫瘤已經(jīng)成為兒童疾病死亡的首要原因。常見(jiàn)的兒童惡性實(shí)體瘤有腎母細(xì)胞瘤、肝母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤,神經(jīng)母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤、卵黃囊瘤等。兒童惡性實(shí)體瘤常用的治療包括手術(shù)、化療、放療、免疫治療、介入治療、中醫(yī)治療、腫瘤的誘導(dǎo)分化治療等,而化療是目前治療兒童惡性腫瘤和有效防治腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的主要手段。盡管新的抗癌藥物和化療方案不斷推出,但治療效果卻不盡如人意,其中一個(gè)重要的原因就是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞不僅對(duì)使用過(guò)的抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥,而且對(duì)多種未曾使用過(guò)的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥,這種現(xiàn)象稱為多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)。腫瘤多藥耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜,現(xiàn)在普遍認(rèn)為其與多種耐藥相關(guān)的酶和蛋白有關(guān),如:P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein,M RP1)、肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-associated protein,LRP)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase-pi,GST-π)、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomeras,Topo-Ⅱ)等[1-2]。本研究旨在通過(guò)對(duì) 40例兒童常見(jiàn)實(shí)體惡性腫瘤中耐藥基因表達(dá)蛋白的分析,探討兒童常見(jiàn)惡性腫瘤的耐藥機(jī)制,為臨床化療制定敏感的個(gè)體化化療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2000～2005年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的5種兒童常見(jiàn)惡性實(shí)體瘤病例40例,資料完整;病理石蠟切片由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院病理科提供,包括:腎母細(xì)胞瘤(10例)、惡性淋巴瘤(19例)、橫紋肌肉瘤(3例)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤(3例)、卵黃囊瘤(5例)。其中男23例,女 17例;年齡小于1歲8例,1～3歲11例,大于3歲 21例,平均年齡4歲,中位年齡為4.2歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,5μ m連續(xù)切片,50℃恒溫箱中固定72h,梯度酒精脫蠟水化,其余步驟按照SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹(shù)膠固封。鼠抗人 P-gp、M RP、LRP、GST-π、Topo-Ⅱ單克隆抗體及SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑試劑盒均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。使用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。P-gp、M RP1、LRP、GST-π表達(dá)均位于細(xì)胞膜或者細(xì)胞漿,Topo-Ⅱ表達(dá)位于細(xì)胞核上,陽(yáng)性反應(yīng)為棕色;每張切片在高倍鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野,計(jì)算其陽(yáng)性率。判斷標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10%為陰性(-),10%～25%為(+),25%～75%為(++),＞75%為(+++);達(dá)(++)以上為陽(yáng)性,表示腫瘤對(duì)該耐藥基因所介導(dǎo)的藥物具有耐受性。

表1 5種耐藥蛋白在6種常見(jiàn)兒童惡性腫瘤中的表達(dá)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5種耐藥基因蛋白在40例兒童常見(jiàn)惡性腫瘤中的表達(dá)情況見(jiàn)表1。

圖1 腎母細(xì)胞瘤耐藥蛋白的表達(dá)(箭頭示陽(yáng)性表達(dá),×400)

圖2 霍奇金淋巴瘤耐藥蛋白的表達(dá)(箭頭示陽(yáng)性表達(dá),×400)

2.2 37例有兩種或兩種以上耐藥基因表達(dá)陽(yáng)性,共表達(dá)率達(dá)92.5%,明顯高于單基因表達(dá)率(P＜0.05)。其中9例 5種耐藥基因表達(dá)均為陽(yáng)性,共表達(dá)率達(dá)22.5%。

2.3 5種耐藥基因蛋白在兒童常見(jiàn)惡性腫瘤表達(dá)的免疫組化結(jié)果見(jiàn)圖1～6。

圖3 非霍奇金淋巴瘤耐藥蛋白的表達(dá)(箭頭示陽(yáng)性表達(dá),×400)

圖4 神經(jīng)母細(xì)胞瘤耐藥蛋白的表達(dá)(箭頭示陽(yáng)性表達(dá),×400)

圖5 橫紋肌肉瘤耐藥蛋白的表達(dá)(箭頭示陽(yáng)性表達(dá),×400)

圖6 卵黃囊瘤耐藥蛋白的表達(dá)(箭頭示陽(yáng)性表達(dá),×400)

3 討 論

3.1 5種耐藥基因的耐藥機(jī)制 P-gp是由M DR1基因編碼的一種能量依賴性藥物排除泵,當(dāng)藥物進(jìn)入細(xì)胞后,P-gp結(jié)合藥物分子,同時(shí)其A TP位點(diǎn)結(jié)合ATP后釋放能量,使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外,也可直接從胞膜排除藥物,使胞內(nèi)藥物濃度始終維持于低水平,由此可介導(dǎo)植物堿類、阿霉素、紫杉醇、泰素帝等抗癌藥物的耐藥。P-gp在人類正常組織中有不同程度的表達(dá),其中腎上腺、肺臟、胃腸、胰腺、腎臟等組織中表達(dá)較高,而在卵巢、胸腺、骨髓中表達(dá)率很低甚至不表達(dá)[3-4],這也解釋了抗癌藥物為何會(huì)引起對(duì)造血系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p壞從而導(dǎo)致化療療程的縮短或中斷。P-gp主要分布在有分泌功能的上皮細(xì)胞中,可轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、碳水化合物、藥物、色素等物質(zhì),所以其不僅是引起腫瘤組織耐藥的主要機(jī)制之一,而且在機(jī)體分泌、排泄功能中也起著特殊的作用。

MRP與P-gp同屬ABC超家族膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可轉(zhuǎn)運(yùn)多種有機(jī)陰離子物質(zhì),如一些內(nèi)源性或外源性物質(zhì)(還原性谷胱甘肽GSH、葡萄糖醛酸、硫酸鹽共軛結(jié)合物等)。它也是一種ATP依賴泵,能將帶負(fù)電荷的藥物分子逆濃度泵出到細(xì)胞外,還可通過(guò)改變細(xì)胞漿及細(xì)胞器的pH值,使藥物到達(dá)作用部位的靶位點(diǎn)時(shí)濃度減少,從而產(chǎn)生腫瘤耐藥。MRP與P-gp之間存在交叉耐藥種類,包括長(zhǎng)春堿類、阿霉素、足葉乙甙等,均為能與GSH共軛結(jié)合的藥物。

LRP是穹隆蛋白的主要成分,阻止以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物通過(guò)核孔進(jìn)入胞核,并將進(jìn)入胞漿的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到運(yùn)輸囊泡中,以胞吐的方式排出體外,從而影響藥物的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與分布,致靶點(diǎn)藥物有效濃度下降而產(chǎn)生耐藥。LRP分布在人體體腔上皮、分泌器官等正常組織中,也不同程度的表達(dá)于各種腫瘤組織中,主要介導(dǎo)阿霉素、鉑類、柔紅霉素、米托蒽醌、烷化劑等的耐藥。

GST是機(jī)體中催化GSH與親電物質(zhì)發(fā)生結(jié)合的一類酶系,具有多種生物學(xué)功能,結(jié)構(gòu)多樣,分為α、μ、θ、π等膜結(jié)合微粒體,其中GST-π與惡性腫瘤耐藥關(guān)系最密切。卵巢并不是P-gp的富集器官,但GST-π卻是優(yōu)勢(shì)亞型,腫瘤高表達(dá)也正反映了其胚胎特征[5]。GST-π不僅可催化親電物質(zhì)與GSH結(jié)合,本身可和親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合,增加其水溶性促進(jìn)代謝,最終將毒性物質(zhì)從尿液中排出或降解為無(wú)毒性的醇類物質(zhì),從而降低抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用,其只要介導(dǎo)對(duì)順鉑、氮芥類、烷化劑、蒽環(huán)類等的耐藥。

Topo是一種能催化DNA超螺旋結(jié)構(gòu)局部構(gòu)型改變的基本核酶,分為Ⅰ、Ⅱ類,其中Topo-Ⅱ與細(xì)胞耐藥關(guān)系密切?；熕幬锿ㄟ^(guò)該酶與DNA交聯(lián)形成共價(jià)復(fù)合物,即可分割復(fù)合物引起DNA斷裂,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶同時(shí)又是許多化療藥物重要的攻擊靶點(diǎn),導(dǎo)致該酶減少或活性下降,使得可分割的復(fù)合物減少,腫瘤細(xì)胞DNA損害減少,并具有修復(fù)力,使腫瘤細(xì)胞不因DNA斷裂而死亡,從而產(chǎn)生耐藥。Topo-Ⅱ表達(dá)越低提示對(duì)化療藥物越不敏感,又因其與腫瘤細(xì)胞的增殖活性密切相關(guān),成為反映腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為和預(yù)后的重要標(biāo)記物。以Topo-Ⅱ?yàn)榘悬c(diǎn)的藥物主要為蒽環(huán)類、鬼臼霉素、阿霉素等。

3.2 5種耐藥蛋白在兒童惡性腫瘤中的表達(dá)特點(diǎn)及共表達(dá)現(xiàn)象 本研究結(jié)果顯示,腎母細(xì)胞瘤、惡性淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵黃囊瘤中 P-gp、M RP、LRP和 GST-π表達(dá)相對(duì)較高,Topo-Ⅱ普遍表達(dá)較低,提示P-gp、MRP、LRP、GST-π的高表達(dá)和Topo-Ⅱ的低表達(dá)均可導(dǎo)致腫瘤組織的耐藥,這與有關(guān)報(bào)道相符。事實(shí)上,腫瘤化療的耐藥性常常是多種耐藥蛋白參與及不同機(jī)制共同作用的結(jié)果[6-7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩種或兩種以上耐藥基因的共表達(dá)率達(dá)92.5%,5種耐藥基因均表達(dá)率達(dá) 22.5%,表明 P-gp、M RP、LRP、GST-π、Topo-Ⅱ 不同程度地同時(shí)參與了腫瘤的耐藥形成,表達(dá)上的差異性與不一致性也正說(shuō)明了影響腫瘤耐藥機(jī)制的多因素性。有學(xué)者提出這些耐藥基因間不存在相互關(guān)聯(lián)性,各自發(fā)揮耐藥作用[8]。因此,聯(lián)合檢測(cè)腫瘤多個(gè)耐藥相關(guān)標(biāo)志,同時(shí)評(píng)估多個(gè)耐藥基因的表達(dá),能更加客觀地反映腫瘤的耐藥情況。臨床上可依據(jù)耐藥機(jī)制的不同優(yōu)化治療方案,實(shí)現(xiàn)個(gè)體化化療,以增強(qiáng)療效。

3.3 耐藥蛋白在兒童惡性實(shí)體瘤中表達(dá)的臨床意義及應(yīng)用兒童惡性腫瘤的耐藥蛋白的進(jìn)一步認(rèn)識(shí),對(duì)于兒童惡性腫瘤的臨床化療的盲目性有一定的指導(dǎo)作用,目前兒童惡性腫瘤的化療方案來(lái)源于書(shū)本、文獻(xiàn)或醫(yī)師的個(gè)人經(jīng)驗(yàn),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)兒童惡性腫瘤的臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。目前治療惡性淋巴瘤的化療藥物有環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、阿霉素、表阿霉素、博萊霉素、長(zhǎng)春花堿、足葉乙甙、氮芥等[9]。本研究結(jié)果顯示兒童惡性淋巴瘤中P-gp耐藥表達(dá)高,MRP1的表達(dá)較低,如P-gp的主要耐藥藥物是阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿等,M RP1的主要耐藥藥物是阿霉素、長(zhǎng)春新堿、鬼臼乙叉甙、柔紅霉素等,在選擇時(shí)以環(huán)磷酰胺、博萊霉素、氮芥、鬼臼乙叉甙等作為一線基礎(chǔ)藥,從而提高對(duì)兒童惡性淋巴腫瘤藥物治療的療效。

兒童惡性腫瘤以胚胎為主,位于軟組織內(nèi),腫瘤與周圍組織的關(guān)系密切,這一特點(diǎn)給手術(shù)造成一定的難度,而通過(guò)術(shù)前化療就可以使瘤體充血減少,瘤體體積縮小,與周圍組織界限更清楚,同時(shí)減少術(shù)中出血。這明顯表明術(shù)前化療的重要性。對(duì)于兒童惡性實(shí)體瘤的治療方法中術(shù)前化療可以作為一種常規(guī)的治療方法。而明確各種兒童腫瘤耐藥基因的表達(dá)特點(diǎn)可以為臨床化療提供理論依據(jù),做到有的放矢,高效、快速的殺滅腫瘤細(xì)胞,提高治愈率,改善患兒的生活質(zhì)量。

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