莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠Caspase-3活化程度的影響

汪瑩,高東明,許棟明,王文,艾厚喜,張麗,李林

腦卒中是影響人類健康的三大疾病之一,嚴(yán)重地威脅著人們的身體健康和生活質(zhì)量。在腦缺血早期,自由基損傷、興奮性神經(jīng)毒性和反復(fù)細(xì)胞膜去極化導(dǎo)致能量衰竭,引起級(jí)聯(lián)式“瀑布反應(yīng)”,破壞了“神經(jīng)血管單元”(neurovascular unit)穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡以及微血管、血腦屏障破壞[1]。中藥在治療腦卒中方面有顯著的臨床療效。莫諾苷是從中藥山茱萸中篩選出的有效成分。前期研究發(fā)現(xiàn),莫諾苷對(duì)SY5Y神經(jīng)細(xì)胞具有抑制過(guò)氧化氫損傷、抑制細(xì)胞凋亡、鈣超載等作用[2-10],可提高局灶性腦缺血再灌注大鼠皮層總抗氧化能力[11],抑制氧化應(yīng)激損傷,從而在基因表達(dá)水平上減少caspase-3的產(chǎn)生[12]。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠caspase-3活化程度的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 莫諾苷由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物室從山茱萸中提取制備,HPLC分析純度大于98.5%。維生素E:北京雙鶴藥業(yè)。caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(caspase-3 Activity Assay Kit):碧云天生物技術(shù)研究所(產(chǎn)品編號(hào):C1116)。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 36只SPF級(jí)Wistar雄性成年大鼠,體重260～280 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證編號(hào):SCXK(京)2006-0009。隨機(jī)分為:假手術(shù)組,模型組,莫諾苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)劑量組和維生素E(35 mg/kg)組,每組6只。采用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,術(shù)后連續(xù)灌胃給藥3 d,每天給藥1次,其中假手術(shù)組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.3 模型制備 局灶性腦缺血再灌注模型采用改良Zea Longa線栓法[13]制備。大鼠用 10%水合氯醛0.35 ml/kg腹腔注射麻醉,仰臥位固定于鼠板上,頸部正中切口,鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),結(jié)扎頸外動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈的近心端,動(dòng)脈夾與頸總動(dòng)脈近心端之間結(jié)扎一道縫合線,不扎緊。在頸總動(dòng)脈接近頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處用眼科剪做一斜行細(xì)切口,將直徑為0.26 mm的尼龍線插入,稍扎緊縫合線,推動(dòng)尼龍線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,至距頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處約2 cm時(shí),會(huì)有阻擋感,說(shuō)明栓線已越過(guò)大腦中動(dòng)脈(MCA),到達(dá)大腦前動(dòng)脈(ACA)的起始部。記錄栓塞開(kāi)始時(shí)間,結(jié)扎頸總動(dòng)脈上端?？p合肌肉、皮膚。栓塞后30 min,若此時(shí)大鼠已蘇醒則需要再次將大鼠麻醉,并拔出尼龍線。假手術(shù)組的大鼠除不插入尼龍線外,飲食等其他操作與手術(shù)組相同。

1.4模型成功及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 參照Longa及Bederon的5分制評(píng)分方法[13-14]對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分。將0分、1分及4分大鼠剔除,并補(bǔ)充各組設(shè)計(jì)所需大鼠數(shù)量。

1.5 caspase-3活性檢測(cè) 腦缺血再灌注后72 h迅速斷頭取腦,冰生理鹽水快速漂洗,徹底去除標(biāo)本表面血液后,于冰盤上分離缺血側(cè)腦組織。將大鼠缺血側(cè)海馬組織在電子天平上稱重后,按照每10 mg組織加入100 μ l裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿;把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中,冰浴再裂解5 min后,4℃、15000 g離心15 min。caspase-3活性檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作要求進(jìn)行,同時(shí)取少量樣品用Bradford法測(cè)定蛋白濃度,并按試劑盒提供的酶活力單位定義進(jìn)行換算。

2 結(jié)果

與假手術(shù)組相比,模型組caspase-3活性顯著上升(P ＜0.001);服用莫諾苷 30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg后,活性呈劑量依賴下降(P＜0.05);服用維生素E后,caspase-3活性顯著降低(P＜0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各組caspase-3活性比較(U)

3 討論

腦缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)在缺血性腦血管的病理生理過(guò)程起著重要的作用。腦梗死后超早期溶栓治療是恢復(fù)腦血流,挽救缺血腦組織的最佳方案;但血液再灌注會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),腦缺血再灌注損傷過(guò)程與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系,凋亡機(jī)制參與腦缺血再灌注損傷已成為臨床研究的熱點(diǎn)。

凋亡機(jī)制涉及一組半胱氨酸蛋白酶家族,稱為caspases。caspase家族是一大類凋亡的調(diào)控因子,是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和最后的執(zhí)行者。研究表明,在caspase家族中,caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)“瀑布”下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶[15-16]。它在正常細(xì)胞中以酶原形式存在,也稱Pro-caspase-3;當(dāng)受到凋亡刺激因素(缺血、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等)作用后,caspase-3前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽,然后再在大小亞基之間切割釋放大小亞基,并進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體即活化caspase-3,從而形成酶的活化形式并作為凋亡的效應(yīng)分子執(zhí)行凋亡過(guò)程?；罨腸aspase-3可以激活核因子、細(xì)胞骨架蛋白及DNA裂解酶等,引起細(xì)胞形態(tài)的變化,如出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、DNA裂解、染色質(zhì)濃縮和凋亡小體的形成等,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase-3在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用。

活化的caspase-3作為凋亡最終的主要執(zhí)行者,其活性的變化間接反映組織細(xì)胞損傷的程度。已有實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blot的方法證明莫諾苷可在基因水平上減少Pro-caspase-3的產(chǎn)生[12],即降低酶原的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)利用分光光度法對(duì)caspase-3的活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明莫諾苷能夠抑制腦缺血再灌注損傷后腦組織中caspase-3活性的升高。結(jié)合已有研究[7,12],我們推測(cè)莫諾苷可能對(duì)caspase-3的基因表達(dá)和caspase-3蛋白酶的激活均有抑制作用,減少腦缺血再灌注后腦組織中caspase-3的表達(dá)與激活,從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,達(dá)到對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

莫諾苷在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的抗凋亡能力,能抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠caspase-3的活化。其神經(jīng)保護(hù)作用值得進(jìn)一步研究探討。

[1]Lo EH,Dalkara T,Moskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunities in stroke[J].Nature Rev Neurosci,2003,4(5):399-415.

[2]Wang W,Sun FL,An Y,et al.M orroniside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity[J].Eur J Pharmacol,2009,613:19-23.

[3]Wang W,Huang WT,Li L,et al.Morroniside prevents peroxideinduced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cell[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28(2):293-305.

[4]王文,孫芳玲,安宜,等.莫諾苷抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2009,15(5):428-430.

[5]王文,孫芳玲,安宜,等.莫諾苷抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞鈣超載和細(xì)胞毒[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2009,15(3):201-202.

[6]孫芳玲,王文,安宜,等.莫諾苷抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷作用[J].中國(guó)藥物與臨床,2008,8(11):843-845.

[7]艾厚喜,王文,孫芳玲,等.莫諾苷抑制H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)中藥雜志,2008,33(9):2109-2112.

[8]王文,黃文婷,艾厚喜,等.中藥誘導(dǎo)腦成體神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)驗(yàn),2007,13(1):26-29.

[9]黃文婷,王文,艾厚喜,等.莫諾苷對(duì) SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)損傷的保護(hù)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)驗(yàn),2007,13(9):839-841.

[10]艾厚喜,黃文婷,王文,等.莫諾苷抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)驗(yàn),2007,13(11):1023-1025.

[11]艾厚喜,李蕾,許棟明,等.莫諾苷對(duì)局灶性腦缺血在灌注大鼠皮呈總抗氧化能力的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2009,15(9):833-834.

[12]王文,許棟明,相婕,等.莫諾苷對(duì)大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)凋亡的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2009,15(12):1101-1103.

[13]Longa EZ,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[14]Bederson JB,Pitts LH,T suji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-476.

[15]Hu BR,Liu CL,Ouyang Y,et al.Involvement of caspase-3 in cell death after hypoxia-ischemia declines during brain maturation[J].J Cereb Blood Flow Metab,2000,20(9):1294-1300.

[16]Han BH,D'Costa A,Back SA,et al.BDNF blocks caspase-3 activation in neonatal hypoxia-ischemia[J].Neurobiol Dis,2000,7(1):38-53.