粉防己堿與抗腫瘤藥物相互作用對(duì)HNE-1細(xì)胞周期的影響

王洪鵬 葉 琳 王 馳 陳鴻雁"

粉防堿（TET）是防己科植物粉防己 （Stephania tetrandra S.Moore）的主要活性成分。資料表明粉防己堿具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在腫瘤防治等方面具有很好的應(yīng)用前景。研究表明，粉防己堿能明顯增強(qiáng)柔紅霉素（DNR）和長春新堿（VCR）殺傷白血病細(xì)胞的能力[1]。但是粉防己堿對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞株作用報(bào)道較少?；熕幬飳?dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生變化，細(xì)胞增殖受到抑制，最終誘發(fā)細(xì)胞調(diào)亡從而殺傷腫瘤細(xì)胞，這是化療藥物的常見機(jī)制之一[2]。有關(guān)抗腫瘤藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響報(bào)道較多，但藥物相互作用引起耐藥細(xì)胞和非耐藥細(xì)胞細(xì)胞周期變化的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究以鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞儀分別檢測天然藥物TET和VRP分別與4種常用抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兩細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響，并進(jìn)行比較，為進(jìn)一步探討TET的臨床藥理作用提供基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）細(xì)胞系和照射、培養(yǎng)條件：人鼻咽癌（HNE-1）細(xì)胞株，由重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)超生工程研究所惠贈(zèng)。（2）試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBlo，USA.），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），鹽酸維拉帕米注射液（VCR，購自上海禾豐制藥有限公司）；TET（標(biāo)準(zhǔn)品，濃度98%，購自浙江金華制藥廠），二甲基亞砜 （DMSO，分析純，蘇州工業(yè)園區(qū)正興化工研究院），四甲基偶氮唑鹽（MTT，北方同正生物制品公司）。（3）儀器：二氧化碳孵箱 （美國LRBODEL），超凈工作臺(tái) （蘇州凈化設(shè)備廠），倒置顯微鏡 （重慶光學(xué)儀器廠，XSZ-D2型），Varian 600C型直線加速器（美國）；光學(xué)顯微鏡（Olympus）；超低溫冰箱（-86℃，Nuaire，美國）；Mikro 22R 低溫高速離心機(jī)（Hettich，德國）；臺(tái)式離心機(jī)（LD4-2，北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；流式細(xì)胞儀FACSCalibar（BECTONDICKINSON，美國）。

1.2 方法 （1）分組：1組為VCR+TET，VCR+VRP；2組為BLM+TET，BLM+VRP；3組為 5-FU+TET，5-FU+VRP；4組為DDP+TET，DDP+VRP。將上述每組中的兩種藥物分別處理HNE-1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。以不加任何藥物的HNE-1、細(xì)胞為對(duì)照組。（2）FCM檢測不同藥物作用下細(xì)胞的周期改變：取對(duì)數(shù)生長期 HNE-1（1 × 107/mL），以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 2 次，加入3mL無血清RPMI-1640培養(yǎng)液使細(xì)胞同步化，12h后將無血清培養(yǎng)液棄去，換為3mL含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液，除對(duì)照組外，為4種抗腫瘤藥分別與TET、VRP聯(lián)用，各藥物加入量分別為 TET （1.5ug/mL）、VRP（0.1ug/mL）VCR（1.5ug/mL）、BLM（1.5ug/mL）、DDP（1.0ug/mL）、5-Fu（2.1ug/mL）。24h 后收集細(xì)胞，胰酶消化，PBS液洗滌2次，乙醇固定后，0.05%PI染色30min，上機(jī)檢測，以Modfit LT 2.0軟件分析細(xì)胞周期。以上藥物濃度由本課題組前期研究得出，為抑制率低于10%的低毒劑量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組細(xì)胞周期的測定 不加任何藥物的HNE-1細(xì)胞周期分布：G0/G1為45.44%，S為45.07%，G2/M為9.49%。

2.2 各用藥組藥物對(duì)HNE-1細(xì)胞周期的影響 見表1～表4。表1示VCR與VRP、TET聯(lián)用使細(xì)胞在G0/G1期阻滯；表2示BLM與VRP作用，使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，處于該期的HNE-1細(xì)胞為79.95%；BLM與TET作用，使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，處于該期細(xì)胞數(shù)為50.77%；表3示TET和5-Fu藥物相互作用促使細(xì)胞周期變化，發(fā)生明顯的G0/G1期阻滯；表4示TET和DDP藥物相互作用促使細(xì)胞周期變化，發(fā)生明顯的 G0/G1期阻滯。綜上所述，可知：（1）TET、VRP與4種抗腫瘤藥物相互作用結(jié)果相似，均可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株發(fā)生G0/G1阻滯。（2）DDP和5-Fu與 TET、VRP相互作用較 VCR和BLM顯著。

表1 VCR與藥物相互作用對(duì)細(xì)胞周期的影響

表2 BLM與藥物相互作用對(duì)細(xì)胞周期的影響

表3 5-Fu與藥物相互作用對(duì)細(xì)胞周期的影響

表4 DDP與藥物相互作用對(duì)細(xì)胞周期的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，TET具有極強(qiáng)的體外逆轉(zhuǎn)MDR的作用，其體外逆轉(zhuǎn)MDR的活性是維拉帕米的10倍，能完全逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR和KBV200細(xì)胞株的耐藥性，其機(jī)制為通過調(diào)節(jié)P-gp增強(qiáng)MDR相關(guān)性藥物的細(xì)胞毒性[3]。Hollstein等[4]的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，TET在體內(nèi)能通過降低多藥耐藥基因表達(dá)和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性而干擾多藥耐藥的產(chǎn)生。總之，現(xiàn)有研究表明，TET毒副作用小，不影響化療藥物藥代動(dòng)力學(xué)，是非常具有開發(fā)前景的新一代MDR逆轉(zhuǎn)劑[5，6]。但是粉防己堿在頭頸腫瘤細(xì)胞周期方面的研究鮮有報(bào)道。

抗腫瘤藥物常通過引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。有DNA損傷的細(xì)胞常被阻滯在G1期，防止受損的DNA進(jìn)入S期復(fù)制；或被阻滯在G2期，以防止在M期進(jìn)行異常分裂[3]。將細(xì)胞阻滯在G1期或G2期，會(huì)使大部分含DNA損傷的細(xì)胞在未得到修復(fù)的情況下進(jìn)入細(xì)胞分裂期，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖性死亡增加，理論上能夠提高化療的敏感性。在長期的臨床實(shí)踐及實(shí)驗(yàn)研究中，人們已發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物與中醫(yī)藥聯(lián)合應(yīng)用能提高臨床療效，優(yōu)于單純西藥治療，但對(duì)其機(jī)制的了解還不夠深入。

本研究以鼻咽癌HNE-1細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞儀檢測天然藥物TET和VRP與4種常用抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)兩細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，TET與腫瘤藥物相互作用，可使鼻咽癌耐藥細(xì)胞株和非耐藥細(xì)胞株均產(chǎn)生細(xì)胞G1期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，這與經(jīng)典化療增敏劑VRP相似，其中VCR與藥物相互作用結(jié)果同BLM相似，而DDP和5-Fu結(jié)果相似，其作用較VCR和BLM顯著。本研究顯示，天然藥物TET和經(jīng)典化療增敏劑VRP均能通過誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞G1期阻滯從而產(chǎn)生化療增敏作用，這為進(jìn)一步將TET作為化療增敏劑和腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑提供了依據(jù)。

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