海南島葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲危害性調(diào)查與種類鑒定初報

黃偉明， 陳綿才， 肖彤斌， 王會芳

（1.海南大學環(huán)境與植物保護學院，儋州 571737；2.海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護所，?？?571100）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是一類可侵害多種農(nóng)作物的重要植物土傳病原物，全世界每年因其造成的經(jīng)濟損失達1 000億美元以上［1］，對蔬菜、花生、煙草和果樹造成的產(chǎn)量損失超過20%［2］。海南地處熱帶，冬季蔬菜種植已成為促進當?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟增長的重要支柱產(chǎn)業(yè)。以瓜類、茄果類和豆類為主體的反季節(jié)瓜菜年栽培面積約10萬hm2。由于可耕地面積有限，使得土地復種指數(shù)逐年提高，許多菜區(qū)甚至連年栽種相同類型的作物，造成產(chǎn)量和品質(zhì)不同程度下降，其中一個最主要原因是根結(jié)線蟲病的不斷累積、傳播、蔓延和危害所致。至目前國內(nèi)已報道的根結(jié)線蟲近40種，寄主涉及2 000多種植物，但不同生境下其種類分布復雜，種間乃至種內(nèi)存在著一定的寄主專化性［3］。作者針對海南島獨特的地理和氣候條件下根結(jié)線蟲侵染葫蘆科蔬菜的狀況進行調(diào)查，并對病原的種類進行鑒定，以期為當?shù)厥卟烁Y(jié)線蟲病綜合防治技術體系的組建和應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 根結(jié)線蟲危害性調(diào)查

于2008年10月至2009年2月從海南島11個市縣葫蘆科蔬菜主產(chǎn)區(qū)采樣，采樣點及寄主如表1。選取受害嚴重植株，挖開表土，觀察其根部根瘤數(shù)量，判斷是否感染根結(jié)線蟲，并拍照。按五點法取樣，每點調(diào)查2株，每塊地共調(diào)查10株，進行病情分級和記載，計算根結(jié)指數(shù)。

病情分級標準：0級－根系無根結(jié)；1級－根系有少量根結(jié)；3級－2／3根系有蟲癭；5級－根系布滿小根結(jié)，并有次生根結(jié)；7級－根系形成根結(jié)團［4］。

1.2 樣本采集與培養(yǎng)

挖取根部土壤約500 g和染病根，置于塑料袋中，封口并標記。溫室條件下將病根和病土接種到預先用滅菌土培植的盆栽番茄上，保存線蟲原始種群，45 d后從染病番茄根系上挑取單卵塊進行純化培養(yǎng)。

1.3 會陰花紋制作與鑒定

用挑針在體視顯微鏡下解剖根結(jié)，每個種群挑取成熟雌蟲20頭移入硬塑料板上清水滴中，剔除雜物并進行修切，清水中清洗3次，然后將包含完整會陰花紋且大小合適的角質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到載玻片上，加蓋玻片。干燥后，在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照。

1.4 同工酶分析

根結(jié)線蟲的蘋果酸脫氫酶（Mdh）和酯酶（Est）同工酶的活性分析參照Esbenshade等的程序［5］。采用7%聚丙烯酰胺膠垂直電泳，膠厚為1.5 mm，每孔加入20頭純化培養(yǎng)的年輕雌蟲酶提取物。電泳后，將膠在蘋果酸脫氫酶染液中染色5～10 min至出現(xiàn)清晰的酶條帶，然后將同一膠在酯酶染色液中染色20～30 min至出現(xiàn)清晰的酶條帶為止。以已鑒定的爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）樣本作為參照系。蘋果酸脫氫酶和酯酶表型的命名按照Esbenshade等的方法［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲危害性

調(diào)查結(jié)果表明，海南島葫蘆科蔬菜受根結(jié)線蟲的危害嚴重，被調(diào)查菜田的株發(fā)病率均在50%以上，澄邁縣的絲瓜和苦瓜、瓊中縣的南瓜發(fā)病率高達100%。瓊海中原、瓊中腰子、臨高多文、澄邁長安、臨高龍波、瓊中營根、五指山茶場、定安雷鳴等8個主產(chǎn)菜區(qū)的病情指數(shù)均超過30。其中瓊中腰子、澄邁長安和瓊中營根3個采樣點的病情指數(shù)分別達到了47.12、47.14和40（表1）。

表1 海南葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲危害調(diào)查結(jié)果

2.2 根結(jié)線蟲形態(tài)學鑒定

對雌蟲會陰花紋進行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)雌蟲會陰花紋變異很大，初步認為寄生于葫蘆科蔬菜的根結(jié)線蟲種類有南方根結(jié)線蟲（Meloidogyneincognita）、爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）和疑似新種或新紀錄種（Meloidogynesp.）。

南方根結(jié)線蟲形態(tài)特征描述：雌雄異形，雌蟲蟲體膨大，呈球形或梨形，有明顯突出的頸部，唇區(qū)稍突起，略呈帽狀；會陰花紋變異較大：花紋呈橢圓形或近圓形，通常背弓高，背弓頂部圓或平，有時呈梯形，背紋緊密：花紋背面和側(cè)面的線紋呈波浪形或鋸齒狀，有的平滑，側(cè)線不明顯，側(cè)面線紋有時分叉。2齡幼蟲線形［7］。所有調(diào)查的市縣均有分布。

爪哇根結(jié)線蟲形態(tài)特征描述：雌雄異形，雌蟲蟲體膨大，近球形至洋梨形，有突出的頸部，唇區(qū)有1個環(huán)紋；會陰花紋背弓圓而扁平，線紋平滑至波浪形，有一清楚的側(cè)線將花紋的背線和腹線分開，分為明顯的背區(qū)和腹區(qū)，一般無線紋通過側(cè)線。2齡幼蟲線形［8］。主要分布在臨高、五指山和萬寧3個市縣。

疑似新種或新紀錄種Meloidogynesp.形態(tài)特征描述：雌雄異形，雌蟲蟲體膨大，呈球形或梨形，有突出的頸部，唇區(qū)稍突起，呈錐狀；會陰花紋肩部明顯，背弓高，線紋平滑，側(cè)線不明顯，側(cè)面線紋分叉明顯。2齡幼蟲線形。主要分布在瓊海和儋州。

圖1 海南省侵染葫蘆科蔬菜的根結(jié)線蟲雌蟲代表性會陰花紋（400×）

2.3 同工酶鑒定結(jié)果

在供試種群中，共測得酯酶譜帶類型3種，結(jié)合比較形態(tài)學特征，分別判定為I1（Rf為0.470），代表M.incognita的酯酶譜帶類型；J3（Rf為0.460、0.545和0.590），代表M.javanica的酯酶譜帶類型；S1－M2a（Rf為0.465和0.480），基于其獨特性，認為代表1個疑似新種或新紀錄種Meloidogynesp.的酯酶譜帶類型（圖2）。

圖2 海南省侵染葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲群體的蘋果酸脫氫酶和酯酶表型

通過同工酶電泳技術與比較形態(tài)學相結(jié)合的方法，鑒定了海南島葫蘆科蔬菜上24個根結(jié)線蟲種群，有19個屬于南方根結(jié)線蟲，占總數(shù)的79.17%；有3個屬于爪哇根結(jié)線蟲，占總數(shù)的12.5%；有2個屬于疑似新種或新紀錄種Meloidogynesp.，占總數(shù)的8.3%。南方根結(jié)線蟲是海南葫蘆科蔬菜上的優(yōu)勢種。

3 結(jié)論與討論

海南島葫蘆科蔬菜嚴重遭受根結(jié)線蟲危害，所調(diào)查的主產(chǎn)區(qū)植株發(fā)病率均高于50%，這與該地區(qū)土地利用率增高有關。海南島是我國反季節(jié)蔬菜的重要種植基地，復種指數(shù)的增加，導致了根結(jié)線蟲種群數(shù)量在土壤中逐年增大，生產(chǎn)上應引起注意。建議采用水旱輪作，延長非寄主作物的種植年限，降低根結(jié)線蟲基數(shù)，有條件的地方可以采取陽光消毒和生物熏蒸的措施，以減少土壤中的線蟲數(shù)量。

運用比較形態(tài)學和同工酶方法鑒定出海南葫蘆科蔬菜根結(jié)線蟲有南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和1個疑似新種或新記錄種，其中南方根結(jié)線蟲為優(yōu)勢種，這與前人報道的結(jié)果基本相符［9－10］。疑似新種或新紀錄種的形態(tài)學和同工酶譜帶均有別于常見4個種，但由于獲得和掌握可比對試驗數(shù)據(jù)的局限性，有待于進一步開展其分子特征觀察與遺傳背景分析予以準確鑒定與描述。

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