黃連解毒湯對(duì)幼齡自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮功能影響研究*

岳桂華，張志偉，孟子譽(yù)

(廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧 530011)

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是臨床常見(jiàn)的心血管疾病之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓階段時(shí)存在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[1]，內(nèi)皮功能障礙甚至成為高血壓病人不良結(jié)局的預(yù)測(cè)因子，但其與高血壓發(fā)病的因果關(guān)系卻尚未明了。高血壓和內(nèi)皮功能障礙具有相似的病因和發(fā)病機(jī)制，目前多數(shù)認(rèn)為高血壓是內(nèi)皮功能障礙的病因，但也有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮功能紊亂可出現(xiàn)在血壓增高以前一段時(shí)期前[2]。SHR是國(guó)際公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，研究幼齡SHR可以更好地了解內(nèi)皮功能情況。因此，我們以幼齡SHR為研究對(duì)象，并以黃連解毒湯為施加因素，觀察幼齡SHR內(nèi)皮功能變化，探討黃連解毒湯防治高血壓的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

雄性6周自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)16只和同類6周正常血壓wistar-kyoto(WKY)8只，體重80g～130g，SHR購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)SCXK(京)2006～0009)。WKY組為空白對(duì)照，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)SCXK(桂)2006-0003)，SHR隨機(jī)分為黃連解毒湯組、模型組每組8只。動(dòng)物正常光照，食水自由攝取，室溫控制在18℃ ～22℃之間。

1.2 方法

1.2.1 藥物干預(yù) 黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按3∶2∶2∶3比例組成，其藥材均購(gòu)于廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院藥劑科，專人負(fù)責(zé)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，煎煮取汁，濃縮成清膏(1g清膏相當(dāng)于1.5g黃連解毒湯生藥)。蒸餾水稀釋1倍后，HLJD組按10ml/kg/d灌胃，模型組和正常對(duì)照組按10ml/kg/d灌服蒸餾水。藥物充分用蒸餾水混勻，于每日上午9時(shí)灌胃給藥，SHR對(duì)照組及WKY正常對(duì)照組每日同時(shí)用等容積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥6周。

1.2.2 試劑及儀器 ET-1和vWF試劑盒由武漢中美科技有限公司生產(chǎn);SOD、MDA試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn);BP-6大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn);MK3酶標(biāo)儀由美國(guó)Thermo生產(chǎn);1575洗板機(jī)由美國(guó)BIO-RAD生產(chǎn)。

1.2.3 血壓測(cè)量 分別于給藥前及給藥后1、2、4、6周，測(cè)量大鼠安靜清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)。每只鼠連續(xù)測(cè)量SBP 3次，間隔60s，取其平均值為當(dāng)次所測(cè)得血壓值。

1.2.4 樣品采集與測(cè)定 大鼠給藥6周后，用2%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血6ml，按3000r/min 離心10 min，用于 NO、ET-1、vWF、SOD和MDA水平的檢測(cè)。標(biāo)本均置于－20℃冰箱保存待測(cè)。ET-1、vWF測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)。ET-1產(chǎn)品編號(hào)為E0482r，vWF產(chǎn)品編號(hào)為E0833r，操作步驟均嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。硝酸還原法測(cè)定血漿NO的含量，黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)SOD，硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)MDA。其中血漿NO采用硝酸還原酶法，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度的高低;SOD測(cè)定通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度儀測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，則對(duì)超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)幼齡大鼠血壓的影響

正常情況下6周幼齡大鼠的血壓仍然處于自發(fā)性初始升高的階段。表1顯示，與空白對(duì)照組比較，治療前各組SHR大鼠沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，模型對(duì)照組隨著鼠齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)血壓進(jìn)行性增高，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第2周時(shí)表現(xiàn)出的血壓升高P<0.05，第6周時(shí)的血壓升高P<0.01。而黃連解毒湯組能降低大鼠進(jìn)行性血壓增高的趨勢(shì)，治療6周后血壓前后變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與同時(shí)間段模型組比較，在給藥第4周后對(duì)SHR產(chǎn)生了顯著的降壓作用(P<0.05);與空白對(duì)照組比較，給藥第4周后，黃連解毒組的血壓水平與空白對(duì)照組水平相當(dāng)(P>0.05)。

2.2 對(duì)幼齡 SHR 血漿 NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的影響

表2顯示，與空白組比較，模型組幼齡SHR血漿中 vWF、MDA 升高(P<0.05或 P<0.01)，NO、SOD降低(P<0.05)，ET-1無(wú)明顯變化，表明SHR在高血壓前期已存在內(nèi)皮功能不全。與模型組比較，黃連解毒能夠顯著降低血漿vWF、MDA(P<0.05)，升高 NO、SOD(P<0.05)。

表1 治療前后各組大鼠血壓的變化(s，mmHg，n=8)

表1 治療前后各組大鼠血壓的變化(s，mmHg，n=8)

注:與同時(shí)間段空白對(duì)照組比較:#P<0.05，##P<0.01;與同時(shí)間段模型組比較:＆P<0.05，＆＆P<0.01

組 別 0周 1周 2周 4周 6周空白對(duì)照組 119.68±2.04 115.96±2.86 114.81±3.37 114.36±3.00 115.02±2.08模型對(duì)照組 121.78±5.51 122.47±8.32 124.66±9.31# 130.02±13.18# 136.64±2.72##黃連解毒組 123.84±8.84 124.04±9.63 125.00±8.79# 116.25±5.06＆ 116.56±3.08＆

表2 治療前后各組大鼠血漿NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的變化(s)

表2 治療前后各組大鼠血漿NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的變化(s)

注:與空白對(duì)照組比較:#P<0.05，##P<0.01;與模型對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01

組 別 動(dòng)物數(shù) NO(μmol/L)ET-1(pg/ml)vWF(ng/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)空白對(duì)照組 8 31.141±6.964 73.732±16.262 2740.514±939.512 132.809±14.692 2.990±0.453模型對(duì)照組 7 20.795±7.037# 86.979±11.941 6940.451±843.673## 114.652±15.261# 4.170±0.408#黃連解毒組 8 33.807±9.771* 78.307±19.495 5571.707±1322.095##*137.920±16.033* 3.512±0.995*

3 討論

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是1963年Okamoto用Wistar大鼠培育而成的，其被毛呈白色，無(wú)明顯原發(fā)性腎臟或腎上腺損傷，心血管疾病發(fā)生率高。SHR從發(fā)病機(jī)制、高血壓心血管并發(fā)癥、外周血管阻力變化、對(duì)鹽的敏感性等多方面來(lái)講，都與人類高血壓患者相似，是目前國(guó)際公認(rèn)的最接近于人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，是基礎(chǔ)研究及藥物篩選的首選。該種大鼠出生后3～4周血壓開(kāi)始升高，12～24周時(shí)達(dá)到高峰，因此出生后4～12周是血壓持續(xù)升高的重要階段。

黃連解毒湯首載于葛洪《肘后備急方》，但未給出方名，王燾《外臺(tái)秘要》始冠以黃連解毒湯之名。本方由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味中藥按比例配伍組成，其中以黃連瀉心火、兼瀉中焦之火為君;黃芩清肺熱、瀉上焦之火為臣;黃柏瀉下焦之火，梔子通瀉三焦之火，導(dǎo)熱下行，合為佐使，共收瀉火解毒之功。黃連解毒湯及其配伍成分在心血管疾病的防治中起著越來(lái)越重要的作用，在臨床上已用于高血壓等心血管疾病的治療。我們觀察表明，6周齡的SHR血壓與WKY有增高的趨勢(shì)，但無(wú)明顯差異(P>0.05);8周齡模型組增高明顯，12周齡后非常明顯。研究表明，與模型組比較黃連解毒湯組能降低SHR的血壓(P<0.05)，表明該方能在幼齡SHR控制高血壓的上升。

一般認(rèn)為，高血壓病和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙之間有密不可分的關(guān)系，高血壓是內(nèi)皮損傷的始動(dòng)因素之一[3]。內(nèi)皮損傷程度可以反映高血壓患者病情嚴(yán)重程度，且內(nèi)皮功能障礙有遺傳傾向[4]。原發(fā)性高血壓患者內(nèi)皮功能減退，NO生成減少或生物利用度降低，可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。其機(jī)制是高血壓內(nèi)皮損傷后，NOS作用底物L(fēng)2精氨酸缺乏，NOS活性受限、表達(dá)異常或其輔助因子異常，自由基生成增多，超氧化物歧化酶(SOD)缺乏致超氧陰離子生成，NO生成減少和活性被破壞，且生物利用度降低，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性舒血管作用下降。研究表明[5～7]，正常情況下，機(jī)體各組織包括血漿均含有一定活性的抗氧化酶系，可及時(shí)有效地清除氧自由基。SOD是其中最重要的抗氧化劑，是人體內(nèi)天然的抗氧化酶，通過(guò)催化超氧陰離子自由基的自身氧化還原反應(yīng)，有效清除自由基，維持體內(nèi)自由基的動(dòng)態(tài)平衡，以避免損傷機(jī)體的組織細(xì)胞。應(yīng)用外源性SOD和過(guò)氧化氫酶，可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功，松弛血管平滑肌。NO是一種血管內(nèi)皮舒張因子，具有松弛平滑肌、舒張血管的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以合成NO，后者彌散入血管平滑肌細(xì)胞，活化鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，后者促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，引起平滑肌松弛，血管擴(kuò)張和血壓下降。高血壓病患者SOD水平較對(duì)照組顯著下降，MDA的增加也印證了SOD的下降，提示高血壓病患者存在氧化反應(yīng)增強(qiáng)及抗氧化能力降低，體內(nèi)活性氧增加，引起并加重內(nèi)皮功能失調(diào)。

對(duì)有原發(fā)性高血壓家族史血壓正常子代的研究發(fā)現(xiàn)，其基礎(chǔ)NO分泌減少，除提示內(nèi)皮功能障礙有遺傳傾向外，同時(shí)也說(shuō)明NO分泌減少，內(nèi)皮依賴性的舒張功能受損也是導(dǎo)致高血壓的危險(xiǎn)因素[8]。也有研究表明，有高血壓家族史的正常子代體內(nèi)的ET-1水平并不增高，而NO水平卻顯著性增高，并且有NO水平增高的子代易患高血壓，提示可能這些人的機(jī)體內(nèi)存在NO抵抗。NO和ET-1的分泌失衡是導(dǎo)致高血壓的重要影響因素。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，內(nèi)皮細(xì)胞釋放的很多活性物質(zhì)如凝血酶、ADP、ATP、5羥色胺等舒血管作用變?yōu)榭s血管作用，從而影響ET-1、NO的協(xié)調(diào)狀態(tài)，破壞了自身調(diào)節(jié)體系的平衡，使得ET合成增多，影響NO的合成和釋放，導(dǎo)致血管張力調(diào)節(jié)的紊亂，內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，收縮功能增強(qiáng)，血管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致血壓的升高。而主要是NO生成不足或活性降低，致使內(nèi)皮功能障礙，引起高血壓的發(fā)生。同時(shí)研究表明，vWF是內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能不全的標(biāo)記物之一，血漿vWF升高表明存在內(nèi)皮功能障礙。

我們研究表明，模型組SHR血漿中NO、SOD降低，vWF、MDA上升，較空白對(duì)照有明顯差異(P<0.05)，ET-1有上升的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，表明SHR在血壓達(dá)到高峰前已存在內(nèi)皮功能不全。提前應(yīng)用黃連解毒湯能保護(hù)受損的內(nèi)皮功能，這也體現(xiàn)了中醫(yī)的“治未病”思想和理念。但黃連解毒湯預(yù)防高血壓的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

[1]Tanner FC，Boulanger CM，Luscher TF.Endothelium-derived nitric oxide，endothelin，and platelat vessel wall interaction:alteration in hypercholesterolemia and atherosclerosis.Seminars in thrombosis and hemastasis.1993，19:167-75.

[2]陳明，胡申江，張健，等.不同危險(xiǎn)度的高血壓人血管內(nèi)皮功能.高血壓雜志2006，14(4):257-260.

[3]Spencer CG，Martin SC，F(xiàn)elmeden DC，et al.Relationship of homocysteine to markers of platelet and endothelial activation in“high risk”hypertensive:a substudy of the Anglo2Scandinavian Cardiac Outcomes Trial[J].Int J Cardiol，2004，94(223):293-300.

[4]Li Lijun， Yu chengman， Geng Shuren， et al.Endothelial dysfunction in young normotensive subjects with a family history of essential hypertension[J].Xi′an MED UNIV，2002，14(1):81-85.

[5]George S，Chaturvedi P.Protective role of ocimum canum plant extract in alcohol-induced oxidative stress in albino rats[J].Br J Biomed Sc，2008，65(2):80-85.

[6]El-Nab，i KamelMA，ShehataM.Effect of toluene exposure on the antioxidant status and apoptotic pathway in organs of the rat[J].Br J Biomed Sc，2008，65(2):75-79.

[7]Hirsch AT. Vasculardisease， hypertension and prevention:“fromendothelium to clinical events”[J].JACC，2003，42:377-379.

[8]McAllister AS，Atkinson AB，Johnston GD，et al.Basal nitric oxide production is impaired in offspring of patients with essential hypertension[J].Clin Sci(Lond)，1999，97(2):141-147.