川芎嗪促進(jìn)腦缺血耐受形成的作用及機(jī)制研究

胡永紅，周愛民，田 野，朱鈺寶

(石家莊市中醫(yī)院河北醫(yī)科大學(xué)，河北石家莊 050051)

本實(shí)驗(yàn)觀察川芎嗪干預(yù)腦預(yù)缺血(CIP)的效果及其促進(jìn)腦缺血耐受的形成，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康昆明小鼠96只，雌雄不拘，體重30g～40g，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)2d后用于實(shí)驗(yàn)。鹽酸川芎嗪注射液購自石家莊樂仁堂藥店;10%水合氯醛由天津市化學(xué)試劑廠生產(chǎn);多聚甲醛為張家口市化工試劑廠生產(chǎn);Bax兔多克隆抗體、Bcl-2鼠單克隆抗體、生物素標(biāo)記二抗由北京中山生物公司生產(chǎn);NO試劑盒、NOS試劑盒為南京建成生物公司;TGL-16G-A型低溫高速離心機(jī)由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn);DK-600A型電熱水浴恒溫箱由上海一恒科技公司生產(chǎn);光學(xué)顯微鏡為重慶光電儀器公司生產(chǎn);病理圖像采集系統(tǒng)為日本olympus。

1.2 方法

將96只健康昆明小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預(yù)BIT組4組，每組24只。TMP干預(yù)組用川芎嗪按40mg/kg/d腹腔注射，連續(xù)3d;假手術(shù)組、缺血損傷組腹腔注射等量生理鹽水。第1次腹腔注射30min后所有小鼠經(jīng)10%水合氯醛0.33ml/100g腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸前正中開口，鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。BIT模型組、TMP干預(yù)BIT組用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈6 min作為預(yù)處理，然后恢復(fù)灌流。假手術(shù)組、缺血損傷組只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈6 min，不阻斷血流。最后1次腹腔注射30min后，所有小鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預(yù)BIT模型組均阻斷血流40 min，然后恢復(fù)灌流;假手術(shù)組只暴露頸總動(dòng)脈40min，不阻斷血流;術(shù)中及術(shù)后注意保暖，正常飲食。術(shù)后24h從各組隨機(jī)選取12只小鼠斷頭處死，迅速剝?nèi)∪X，左側(cè)半球低溫保存，采用生化方法檢測(cè)腦組織NOS活性和NO含量;右側(cè)半球用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，采用免疫組化方法檢測(cè)海馬組織Bax和bcl-2蛋白表達(dá)。其余小鼠于術(shù)后7d全部處死，迅速剝?nèi)∪X，冠狀切取視交叉后1mm～4mm腦片，多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)和神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 參照 Kitagawa和 Kato[1]分級(jí)方法，對(duì)海馬CA1區(qū)域組織學(xué)改變進(jìn)行分級(jí)(0級(jí):無神經(jīng)元死亡;1級(jí):散在的神經(jīng)元死亡;2級(jí):成片的神經(jīng)元死亡;3級(jí):幾乎全部的神經(jīng)元死亡)。

海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度在高倍鏡下記數(shù)雙側(cè)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段未死亡的錐體細(xì)胞數(shù)目，每側(cè)記數(shù)3個(gè)區(qū)段，取其平均數(shù)為神經(jīng)元密度(neuronal density，ND)。

1.3.2 小鼠腦組織NO和NOS含量測(cè)定 用預(yù)冷的生理鹽水制備10%腦組織勻漿，3500r/min離心10min，取上清液，采用分光光度法測(cè)定組織中NOS活性，按每毫克組織蛋白每分鐘生成1nmol NO為1個(gè)酶活力單位。采用硝酸還原酶法檢測(cè)組織中NO2－/NO3－含量(μmol/gprot)間接反映 NO 含量。

1.3.3 Bax及bcl-2蛋白表達(dá)測(cè)定 通過觀察海馬CA1區(qū)bcl-2、Bax陽性細(xì)胞數(shù)占片中神經(jīng)元總數(shù)的百分比分級(jí)情況來反映bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況。bcl-2、Bax陽性細(xì)胞是指胞漿及胞膜內(nèi)側(cè)出現(xiàn)棕黃色顆粒的海馬神經(jīng)元?！罏殛栃约?xì)胞數(shù)20%，+為陽性細(xì)胞數(shù)20% ～50%，++為陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%，+++為陽性細(xì)胞數(shù)>75%。每只小鼠隨機(jī)取1張切片，陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)越高，反映bcl-2、Bax蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)改變

圖1顯示，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)無明顯組織學(xué)損傷，錐體細(xì)胞排列整齊致密，形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，組織學(xué)分級(jí)多為0級(jí)和1級(jí)。圖2顯示，缺血損傷組海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷明顯，主要表現(xiàn)為錐體細(xì)胞缺失較多，殘留的錐體細(xì)胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)錐體細(xì)胞胞核固縮，組織學(xué)分級(jí)多為2級(jí)和3級(jí)，與假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.01)。圖3顯示，BIT模型組海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷較亦明顯，組織學(xué)分級(jí)多為2級(jí)和3級(jí)，與缺血損傷組相比無差異(P>0.05)。圖4、表1顯示，TMP干預(yù)BIT模型組海馬CA1區(qū)組織學(xué)損傷較缺血損傷組和BIT模型組明顯減輕，錐體細(xì)胞排列較整齊，胞核飽滿，核仁較清晰，有散在的錐體細(xì)胞缺失或胞核固縮，組織學(xué)分級(jí)多為1級(jí)和2級(jí)(P<0.05)，但仍明顯低于假手術(shù)組(P<0.01)。

圖1 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)組織學(xué)表現(xiàn)(HE染色×400)

圖2 缺血損傷組組海馬CA1區(qū)組織學(xué)表現(xiàn)(HE染色×400)

圖3 腦預(yù)缺血組海馬CA1區(qū)組織學(xué)表現(xiàn)(HE染色×400)

圖4 川芎嗪干預(yù)組海馬CA1區(qū)組織學(xué)表現(xiàn)(HE染色×400)

表1 術(shù)后7d海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)資料

表2 腦缺血術(shù)后7d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度

表2顯示，與假手術(shù)組相比，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預(yù)BIT模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度明顯降低(P<0.01)。缺血損傷組、BIT模型組之間無顯著性差異(P>0.05)，TMP干預(yù)BIT組神經(jīng)元密度明顯高于BIT模型組和缺血損傷組(P<0.01)。

2.2 術(shù)后24h腦組織NOS活性和NO含量變化

表3顯示，與假手術(shù)組相比，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預(yù)BIT組小鼠腦組織中NOS活性和NO含量明顯升高(P<0.01)，缺血損傷組、BIT模型組之間無顯著性差異(P>0.05)，TMP干預(yù)BIT模型組NOS活性及NO含量較缺血損傷組、BIT模型組明顯降低(P<0.01)。

表3 術(shù)后24h腦組織NOS活性和NO含量變化(s)

表3 術(shù)后24h腦組織NOS活性和NO含量變化(s)

注:*P<0.01 vs假手術(shù)組;△△P<0.01 vs BIT模型組;△P>0.05，☆P<0.01 vs缺血損傷組

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2.3 術(shù)后24h海馬CA1區(qū)Bax和bcl-2蛋白表達(dá)

表4、5顯示，假手術(shù)組Bax可見微弱表達(dá)，bcl-2未見明顯表達(dá)。與假手術(shù)組相比，缺血損傷組、BIT模型組、TMP干預(yù)BIT模型組Bax、bcl-2表達(dá)明顯增多(P<0.01)，而缺血損傷組、BIT模型組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TMP干預(yù)BIT模型組與缺血損傷組比較，Bax表達(dá)明顯減少(P<0.05)，bcl-2表達(dá)明顯增多(P<0.01)。與BIT模型組相比，Bax表達(dá)明顯減少，bcl-2表達(dá)明顯增多(P<0.05)。

表4 術(shù)后24h海馬CA1區(qū)bcl-2蛋白表達(dá)

表5 術(shù)后24h海馬CA1區(qū)Bax蛋白表達(dá)

3 討論

預(yù)處理現(xiàn)象(ischemic preconditioning，IP)最早是由Murry等于1986年在犬心肌缺血模型中發(fā)現(xiàn)的，繼后大量研究進(jìn)一步肯定了心肌缺血預(yù)處理的保護(hù)作用，且已有臨床應(yīng)用報(bào)道。自從1990年腦缺血預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受被發(fā)現(xiàn)以來，這種激發(fā)自身機(jī)制對(duì)嚴(yán)重腦缺血產(chǎn)生保護(hù)作用的方法受到了人們的廣泛關(guān)注[1]。通過對(duì)這種自發(fā)性保護(hù)機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)其中有效的保護(hù)效應(yīng)因子及劑量，最終應(yīng)用于臨床，將具有極大的應(yīng)用前景。從某種意義上講，輕微、短時(shí)的腦缺血不但對(duì)機(jī)體無害，反而具有一定的腦保護(hù)作用，使神經(jīng)元對(duì)抗較重腦缺血的能力得以提高，這引起人們深思。為什么有短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attacks TIA)經(jīng)歷的病人，當(dāng)其發(fā)生腦梗塞時(shí)，與無TIA發(fā)作者相比梗塞面積往往較小，病情也往往較輕，預(yù)后相對(duì)較好。這似乎進(jìn)一步從臨床角度部分驗(yàn)證了CIP的腦保護(hù)作用，然而仍然有相當(dāng)一部分TIA病人會(huì)最終甚至很快發(fā)生腦缺血性卒中。這說明CIP的腦保護(hù)作用是有限的，僅靠臨床病人被動(dòng)TIA發(fā)作來增強(qiáng)腦組織抗缺血缺氧能力是很不充分的，況且TIA本身就預(yù)示著較嚴(yán)重腦缺血發(fā)生的可能性大大增加。因此，采用有效手段來干預(yù)CIP，進(jìn)一步加強(qiáng)其神經(jīng)保護(hù)作用，這對(duì)于作為缺血性腦卒中高危人群的TIA患者來講，可能是更為積極、有效的預(yù)防和治療措施。

川芎(ligustrazine)是臨床上常用的1味活血化瘀藥，為傘行科藁木屬植物的根莖，枯草桿菌的代謝產(chǎn)物，性辛溫，歸肝膽心包經(jīng)，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功能，為血中氣藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，川芎的主要成分含有生物堿、阿魏酸等酚性物質(zhì)，又含有揮發(fā)油內(nèi)酯類以及維生素A、甾醇、葉酸等。大量臨床觀察證明[2～5]，川芎具有清除自由基、抗脂質(zhì)氧化作用、抑制缺血組織細(xì)胞凋亡、抑制鈣超載等作用，在治療缺血性腦血管病及其后遺癥上均有較好療效，而且無明顯毒副作用。而氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是腦缺血后神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制，Bax和bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)基因，NO及NOS也在其中起著重要作用。

bcl-2是一種抗凋亡基因，其廣泛存在于上皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及多種瘤細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)表明，缺血預(yù)處理后，側(cè)腦室持續(xù)輸注 bcl-2反義寡聚脫氧核苷酸72h后再次給予60min的缺血，bcl-2的表達(dá)減少并阻斷缺血預(yù)處理后腦缺血耐受的形成，說明bcl-2在腦缺血耐受的形成中起著重要作用[6]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，bcl-2表達(dá)上調(diào)是預(yù)缺血處理產(chǎn)生腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。Bax是一種促凋亡基因，Bax缺乏鼠腦缺血缺氧后海馬區(qū)受損的細(xì)胞明顯減少。細(xì)胞受刺激后是否存活取決于bcl-2/Bax表達(dá)比率，比值越高，細(xì)胞存活率越高;比值越低，細(xì)胞凋亡率越高。Brambrink等給大鼠腹腔注射3-NPA(一種線粒體毒素)預(yù)處理后，使用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量分析結(jié)合免疫組織化學(xué)分析，轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的 bcl-2/Bax比率均升高。由此可見，Bax基因家族可通過其成員間的相互作用對(duì)細(xì)胞的存活和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，并參與腦缺血耐受的形成。

近些年來，對(duì)NO及NOS在腦預(yù)缺血中的作用越來越受到人們的重視。如觀察缺氧預(yù)處理的離體大鼠海馬腦片的電活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)第2次缺氧復(fù)氧后誘發(fā)電位波幅得到明顯恢復(fù)，NOS阻斷劑7NI抑制腦片神經(jīng)細(xì)胞電活動(dòng)的恢復(fù)，提示cNOS產(chǎn)生的NO參與了缺氧預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。關(guān)于整體下NO是否參與BIT的誘導(dǎo)，導(dǎo)師周愛民的實(shí)驗(yàn)證明，整體水平下NO參與大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞BIT的誘導(dǎo)過程，并發(fā)現(xiàn)CIP誘導(dǎo)BIT時(shí)，可使海馬CA1區(qū)NOS表達(dá)增加，因此提出適量的NO增加，可能是CIP保護(hù)作用的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，BIT模型組與缺血損傷組相比，bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)無明顯變化，小鼠腦組織NO含量及NOS活性無顯著變化，進(jìn)一步證明了6min的預(yù)缺血處理的保護(hù)作用是有限的，它保護(hù)不了后續(xù)40min的嚴(yán)重缺血損傷。川芎嗪干預(yù)BIT模型組Bax蛋白表達(dá)明顯低于BIT模型組，bcl-2蛋白表達(dá)明顯高于BIT模型組，NO含量明顯減低，NOS活性減弱。由此推測(cè)，川芎嗪可能與CIP有協(xié)同作用，進(jìn)一步提高bcl-2/Bax比例，增強(qiáng)抗凋亡效應(yīng)，減少自由基損傷，促進(jìn)腦缺血耐受的形成。這可能是川芎嗪增強(qiáng)CIP腦保護(hù)作用的重要機(jī)制。

然而，CIP腦保護(hù)作用及其機(jī)制的研究剛剛起步，采用中醫(yī)藥手段干預(yù)CIP促進(jìn)腦缺血耐受形成的報(bào)道更少，因此可供借鑒的經(jīng)驗(yàn)極其有限。川芎嗪增強(qiáng)CIP腦保護(hù)作用的價(jià)值到底有多大?川芎嗪干預(yù)CIP增強(qiáng)腦缺血耐受是兩者作用的簡(jiǎn)單相加，還是兩者確實(shí)有協(xié)同效果，抑或是兩者之間根本就不存在相互作用等諸多疑問，均有待進(jìn)一步深入探討。

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