響應(yīng)面分析法優(yōu)化雞腿菇多糖的提取工藝

張東亮 王 薇 吳巧鳳*

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（310053）

雞腿菇，學(xué)名毛頭鬼傘（Copyinds Comatus），又名刺蘑菇、雞腿蘑，因形如雞腿，營(yíng)養(yǎng)豐富，肉質(zhì)肉味如雞絲而得名。目前它已被定為符合聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）要求的集“天然、營(yíng)養(yǎng)、保健”3種功能為一體的16種珍稀食（藥）用真菌之一[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，雞腿菇有效活性成分多糖具有降血糖、調(diào)血脂、抑菌、抗氧化，提高免疫力、抗腫瘤等多種生理活性作用[2-5]，因此對(duì)雞腿菇資源的開(kāi)發(fā)具有重要意義。目前雞腿菇多糖多采用熱水浸提[6]，超聲波[7]或微波輔助提取[2]等方法，但仍以工藝簡(jiǎn)單，多糖提取率較高的統(tǒng)熱水浸提的方法為主[3,6,8]。本試驗(yàn)旨在利用響應(yīng)面分析法[9-11]，優(yōu)化雞腿菇多糖的熱水浸提工藝。

1 儀器和試藥

儀器：S22PC可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申勝生物科技有限公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪于華儀器廠）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪于華儀器廠）。

試藥：雞腿菇干品產(chǎn)自浙江省麗水市，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院資源教研室俞冰副教授鑒定為Copyinds Comatus。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)110833-200503），其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 雞腿菇多糖的含量測(cè)定[12,13]

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱(chēng)取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.0010g，入100mL容量瓶中并加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。從中移取1mL溶液加蒸餾水稀釋?zhuān)ㄈ萦?00mL容量瓶中得濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取雞腿菇干品15份，每份5.0g，加20倍量80%乙醇于80℃水浴加熱回流，趁熱抽濾，反復(fù)3次，每次2h，殘?jiān)詿崴岬秒u腿菇多糖溶液（具體操作步驟見(jiàn)表1和表2中的因素和水平），趁熱抽濾，反復(fù)3次，合并濾液，濃縮后定容于100mL容量瓶，即得供試品溶液。

2.1.2 線(xiàn)性關(guān)系的考察

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于25mL比色管中，各加蒸餾水補(bǔ)至1mL，再各加5%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0mL，渦旋混勻后，冷卻30min至室溫后，以蒸餾水為空白對(duì)照，在490nm波長(zhǎng)處于分光光度計(jì)上分別測(cè)定吸光度，得吸光度Y與濃度X的回歸方程：Y=6.8271X＋0.0695，相關(guān)系數(shù)R=0.9994，表明葡萄糖在0～0.1mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗(yàn)

取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1mL，置于 25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行。平行測(cè)定6次吸光度，結(jié)果RSD為0.93%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液1mL，定容于25mL容量瓶中，移取1mL溶液置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行。分別于10、20、30、40、50、60min后測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.86%，表明在1h內(nèi)吸光度穩(wěn)定，故多糖含量測(cè)定應(yīng)在顯色后應(yīng)在1h內(nèi)完成測(cè)定。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品溶液9份，分別加入3個(gè)水平的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，定容于25mL容量瓶中，從中移取1mL入25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，9次加樣回收率平均值為99.0%，RSD為2.94%，表明本測(cè)定方法可靠。

2.1.6 多糖的含量測(cè)定

分別移取供試品溶液各1.0mL，蒸餾水定容于25mL容量瓶，搖勻后各取1mL，置于25mL比色管中，其余操作按“2.1.2”項(xiàng)中方法進(jìn)行，并在490nm波長(zhǎng)處于分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算多糖含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 雞腿菇多糖的提取工藝研究

2.2.1 響應(yīng)面分析法因素的選取及方案分析

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取雞腿菇干品5.0g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法預(yù)處理得殘?jiān)?，后根?jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合相關(guān)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，選取提取溫度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素，采用SAS（SAS Package Veion 9.1.3）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。以雞腿菇多糖提取率作為響應(yīng)值（Y）。方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素考察表

2.2.2 試驗(yàn)結(jié)果分析

采用SAS 9.1.3軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程：Y=3.097442 + 0.244976X1- 0.070011X2+0.217385X3- 0.176271X1×X1+0.14432X1×X2- 0.030004X1×X3- 0.202157X2×X2+ 0.003289X2×X3-0.12838X3×X3，對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)安排及結(jié)果

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果

由表3可知，在置信區(qū)間95%時(shí)，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為98.65%.可見(jiàn)回歸方程具有較高的顯著性，可用于替代試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，并進(jìn)一步對(duì)回歸方程各項(xiàng)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，見(jiàn)表4。

表4 回歸方程各項(xiàng)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)對(duì)提取率影響都具有顯著性差異。由此可見(jiàn)，各具體實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)面值的影響非簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。同時(shí)做出等值線(xiàn)圖和響應(yīng)面圖（圖1～6），進(jìn)行分析計(jì)算后得出理論最佳提取工藝條件為：提取溫度：76.69℃，料液比：1∶20.19，提取時(shí)間：108.15min，在此條件下雞腿菇多糖的理論提取率為26.03mg/g。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)條件和方差分析結(jié)果，確定最佳提取工藝為：加雞腿菇藥材20倍量的水，在77℃溫度提取108min。

2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

圖1 y= f1(x1，x2)的等值線(xiàn)（x 3=0）

圖2 y=f1(x1，x2)響應(yīng)面值(x3=0)

圖3 y=f2(x2，x3)等值線(xiàn)圖(x1=0)

圖4 y=f2(x2，x3)響應(yīng)面圖（x1=0）

圖5 y=f3(x1，x3)等值線(xiàn)(x2=0)

圖6 y=f3(x1，x3)響應(yīng)面圖(x2=0)

按照最佳熱水浸提工藝進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，提取3次，測(cè)得靈芝多糖的平均提取率為25.69mg/g，RSD為0.65%。表明該工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié) 論

3.1 響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、生物工程、食品工業(yè)等方面[14]。它與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法不同，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)，并能夠通過(guò)相應(yīng)圖尋求在整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。

3.2 根據(jù)響應(yīng)面分析確定雞腿菇多糖的最佳提取工藝參數(shù)：浸提溫度 77℃，料水比 1∶20，浸提時(shí)間108min。按照此工藝條件提取雞腿菇多糖的提取率較高，可達(dá) 25.69mg/g，試驗(yàn)值比理論預(yù)測(cè)值基本吻合，說(shuō)明建立的數(shù)學(xué)模型能較好的預(yù)測(cè)各因素同提取率之間的關(guān)系。

3.3 12號(hào)試驗(yàn)表明在浸提溫度 80℃，料水比 1∶20，浸提時(shí)間120min條件下，提取率為26.48mg/g，比最佳工藝提取率稍高。但其提取過(guò)程中耗能大，且提取時(shí)間比最佳工藝長(zhǎng)，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。因此最終確定雞腿菇多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：浸提溫度77℃，料水比 1∶20，浸提時(shí)間108min，多糖提取率為25.69mg/g。

3.4 雞腿菇作為真菌中的“后起之秀”，因其較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值而越來(lái)越受到重視。由本文研究及文獻(xiàn)報(bào)道可知雞腿菇含有較高的多糖，本文根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際，確定了雞腿菇多糖的熱水浸提的最佳工藝，可為雞腿菇多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]何文.雞腿菇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高開(kāi)發(fā)前景廣闊[J].資源開(kāi)發(fā)與市場(chǎng),2000,12(4):11-12.

[2]胡梅.雞腿蘑深層發(fā)酵技術(shù)及及其多糖分離純化的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006:10-11

[3]吳艷兵,謝荔巖,謝聯(lián)輝等.毛頭鬼傘(Coprinus Comatus)多糖的理化性質(zhì)及體外抗氧化活性[J].激光生物學(xué)報(bào),2007,16(4):438-422.

[4]賈蕊,劉風(fēng)蘭.雞腿菇研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].食品科學(xué),2006,27(12):890-893.

[5]李師鵬,蘇蕾.雞腿蘑多糖的提取及免疫活性抗腫瘤活性的研究[J].中國(guó)商辦工業(yè),2000(1):44-45.

[6]姚毓婧,楊仁智,張勁松等.雞腿菇子實(shí)體多糖分離純化工藝及結(jié)構(gòu)研究[J].微生物通報(bào),2007,34(6):1071-1073.

[7]胡濱,張亞雄,邵偉等.液體深層發(fā)酵雞腿菇菌絲體多糖分離提取研究[J].化學(xué)與生物工程,2004(5):22-23.

[8]吳巧鳳,劉敬娟,陳京等.雞腿菇營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].食品工業(yè)科技,2005,26(8):61-163.

[9]劉軍海,黃寶旭,蔣德超.響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究[J].食品科學(xué),2009,30(2):114-118.

[10]王薇,余陳歡,沈潔等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化白蘇中總黃酮的超聲提取工藝[J].中藥材,2007,30(12):1586-1589.

[11]吳暉,賴(lài)富饒,胡筱波.響應(yīng)面分析法優(yōu)化油菜花粉多糖提取工藝的研究[J].食品與機(jī)械,2007,23(5):66-69.

[12]李毅,趙淑芝,周淑芳等.天年合劑總多糖的含量測(cè)定及薄層色譜鑒別[J].中國(guó)藥業(yè),2006,15(1):35-36.

[13]鄒士玉,馬方勵(lì),丁博.苯酚-硫酸法測(cè)定“潤(rùn)和津露”的粗多糖含量[J].中藥材,2007,30 (11):1470-1472.

[14]楊文雄,高彥祥.響應(yīng)面法及其在食品工業(yè)[J].中國(guó)食品添加劑,2005(2):68-71.