銀屑病皮損中PKB、NF-κBp65、Bcl-xL的表達及相關(guān)性研究

楊 艷 黃振明 張三泉 劉玉梅 朱慧蘭 文海泉

1 廣東省廣州市皮膚病防治所（510095）

2 湖南省長沙市中南大學湘雅二院皮膚科（410011）

銀屑?。╬soriasis）是一種病因復(fù)雜的慢性炎癥性皮膚病，發(fā)病機制未明，主要與感染、遺傳、免疫功能紊亂等因素有關(guān)。其重要病理特征是角質(zhì)形成細胞（kiratinocyte，KC）增生，角化過度伴角化不全，真皮有T淋巴細胞浸潤。近來研究表明，細胞凋亡尤其KC的凋亡異常在銀屑病發(fā)病機制中起到了重要作用。為了對其做進一步的了解，我們采用免疫組織化學法研究PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在銀屑病表皮中的表達，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

30例銀屑病標本來源于廣州市皮膚病防治所2004至2005年門診和住院患者，已經(jīng)組織病理確診，取材前1個月未系統(tǒng)或外用過糖皮質(zhì)激素。其中男20 例，女10例，男女比例2∶1。年齡12～76歲，平均（39.40±14.71）歲。病程1個月～23年，平均（6.23±5.65）年。10例正常對照，為無器質(zhì)性疾患、因外傷等原因手術(shù)的患者正常皮膚，男6例，女4例，男女比例3∶2。年齡18～48歲，平均（31.90±9.48）歲。經(jīng)統(tǒng)計學處理，與銀屑病患者組差異無顯著性。對符合上述入選標準者詳細記錄病史資料，進行PASI評分，銀屑病患者組PASI評分1.58～26.59，平均（14.15±7.94）。取軀干或四肢典型皮損，經(jīng)3.33mol/L（10%）福爾馬林固定24h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片4μm厚。

1.2 試劑

濃縮型兔抗人PKB1（工作滴度1∶100）、Bcl-xL多克隆抗體（工作滴度1∶120）購自武漢博士德生物工程公司。濃縮型鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體（工作滴度1∶150）、SP-9000免疫組織化學染色試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學SP法檢測銀屑病組皮損及正常對照組皮膚中PKB、NF-κBp65、Bcl-xL的表達，陽性對照為相關(guān)試劑公司提供的PKB、NF-κBp65、Bcl-xL的陽性照片，陰性對照為不加一抗。

1.4 結(jié)果判斷

采用銀屑病皮損面積和嚴重程度評分法（Psoriasis Area and Severity Index，PASI）對銀屑病患者予以病情嚴重程度評分。免疫組織化學結(jié)果陽性信號為棕褐色或棕黃色、淡黃色顆粒，定位于細胞質(zhì)及細胞膜。將排除了切片或涂片本底因素后的純免疫組織化學顯色反應(yīng)程度按灰度圖像分析為0（白）至255（黑）個等級，每個等級定義為1個陽性單位（positive unit，PU）。陽性單位測定：用于反映免疫組織化學的顯色強度，從而定量表達免疫組織化學的陽性和陰性反應(yīng)結(jié)果。每例標本隨機取5個200倍視野，以平均值作為該標本PU值進行比較。患者和對照組間PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達的比較采用t檢驗。各組間線性相關(guān)性分析采用Pearson's積差法，并進行偏相關(guān)分析以了解三者與PASI評分的內(nèi)在線性聯(lián)系，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.5 統(tǒng)計學分析

本組資料均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1 PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在正常人及銀屑病患者皮損中的表達

在正常皮膚組織角質(zhì)形成細胞中PKB、NF-κBp65、Bcl-xL均呈現(xiàn)弱陽性或陰性表達，平均PU值分別為（1.28±0.70）、（1.66±0.70）、（1.64±0.76）。銀屑病患者皮損組織角質(zhì)形成細胞中表皮全層出現(xiàn)不同程度的PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達，均呈棕黃色或棕褐色顆粒狀：其中PKB定位于細胞核核膜或近核膜胞質(zhì)，平均PU值為（8.40±3.07）；NF-κBp65在靜止細胞中定位于胞質(zhì)，活化時向胞核移位，平均PU值為（7.45±3.03）；Bcl-xL定位于近核膜胞質(zhì)，平均PU值為（9.27±3.72）。三者在銀屑病患者組的表達均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在正常人皮膚及銀屑病皮損中的表達（陽性單位，±s）

表1 PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在正常人皮膚及銀屑病皮損中的表達（陽性單位，±s）

組別 例數(shù) PKB NF-κBp65 Bcl-xL正常人對照組 10 1.28±0.70 1.66±0.70 1.64±0.76銀屑病組 30 8.40±3.07 7.45±3.03 9.27±3.72 t值 7.225 5.932 6.383 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 銀屑病患者皮損PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達水平和PSAI相關(guān)性比較

三者表達水平與患者PSAI評分間均存在正相關(guān)，r值分別為0.890、0.866、0.988，P均＜0.01，有統(tǒng)計學意義。

2.3 銀屑病患者皮損PKB、NF-κBp65、Bcl-xL表達水平相關(guān)性比較

銀屑病患者皮損PKB和NF-κBp65表達水平間r=0.908，NF-κBp65和Bcl-xL間r=0.921，PKB和Bcl-xL間r=0.915，P均＜0.01。

3 討 論

PKB是1991年發(fā)現(xiàn)的相對分子量約為60×103的具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性的蛋白質(zhì)，在PI3K等介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵作用[1]。在多種細胞中，PKB充當抗凋亡信號激酶的作用。PKB廣泛產(chǎn)生于各組織。既往研究發(fā)現(xiàn)，致癌基因可能通過磷酸化的PKB來阻斷生理性的細胞凋亡，使細胞失去正常的增殖與分化能力從而導(dǎo)致癌變。有研究提示，在子宮內(nèi)膜細胞中存在有PKB參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控細胞的生存與死亡[2]。也有研究提示，PI3K/ PKB抗凋亡信號途徑在調(diào)節(jié)心肌細胞生長、心肌肥大和心力衰竭[3]，而在銀屑病的發(fā)病機制中尚無類似報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，正常人角質(zhì)形成細胞中有PKB的弱陽性表達，而在銀屑病皮損中的角質(zhì)形成細胞中PKB的表達明顯增強，以表皮中、下層表達更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義，而且隨著PASI增高，其表達進一步加強。這表明PKB的過度表達可能與銀屑病的皮損形成存在某種相關(guān)性。

NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)典的NF-κB是p50/p65亞單位組成的異二聚體。正常情況下，NF-κB結(jié)合抑制蛋白IκB以滅活形式存在于胞質(zhì)中。IκB激酶IKK復(fù)合物可磷酸化IκB使其經(jīng)蛋白酶體通路降解進而引起NF-κB激活并轉(zhuǎn)位入核，結(jié)合于抗凋亡基因的啟動子區(qū)激活基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB與細胞凋亡有密切關(guān)系。大量研究表明，NF-κB激活能夠阻斷細胞凋亡通路，為保護細胞免于遭受TNF和其它凋亡刺激因子誘導(dǎo)的凋亡級聯(lián)合反應(yīng)所必需[4,5]。我們的研究結(jié)果表明，正常皮膚角質(zhì)形成細胞中NF-κB呈陰性或弱陽性表達，與正常皮膚相比，銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞中的NF-κBp65表達明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義，且隨著PASI分值增高，表達強度有增加趨勢。表明NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，有可能通過調(diào)控各種抗凋亡基因的表達，而參與銀屑病的發(fā)病機制。

細胞凋亡抑制基因Bcl-xL是近年來發(fā)現(xiàn)的Bcl-2基因家族的新成員，作用與Bcl-2相似。目前對Bcl-2基因家族調(diào)節(jié)細胞增生和凋亡的機制已有所了解，尤其是與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，并發(fā)現(xiàn)其很可能是促成某些良性增生性疾病如銀屑病等的重要因素。有人認為BclxL可能與維持角質(zhì)形成細胞存活，直至終末分化并到達體表才凋亡有關(guān)。Nakagawa、 Krajewski、Takahashi等相繼發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損中的角質(zhì)形成細胞有很高的Bcl-xL表達[6]。這與我們的研究結(jié)果相一致。表明Bcl-xL可能作為一種抗細胞凋亡基因參與銀屑病的發(fā)病機制。

我們的研究證實PKB、NF-κBp65、Bcl-xL在銀屑病皮損中表達均增高。從理論上講，PKB直接磷酸化IKKα，使IKK激活，從而調(diào)節(jié)NF-κB 活性；Meng等[7]發(fā)現(xiàn)在NIH3T3細胞和內(nèi)皮細胞中，NF-κB亞基p65的表達可通過增加PI3K PDK1的活性促進PKB活化，并在轉(zhuǎn)錄水平上增加PKB的表達。Mori等[8]運用瞬時轉(zhuǎn)染分析發(fā)現(xiàn)，TaX（一種病毒蛋白，能抑制凋亡）能激活人類Bcl-xL啟動子活性從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)活，而敲除人類Bcl-xL啟動子序列的NF-κB結(jié)合位點則能顯著減少TaX誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)活。這也證實了NF-κB與Bcl-xL在發(fā)揮抗凋亡作用方面存在某種相關(guān)性?；罨腜KB直接磷酸化BAD S136殘基后，14-3-3 蛋白阻止BAD 與Bcl-2或Bcl-xL在線粒體結(jié)合，同時也阻止Bad和Bcl-2，Bcl-xL在線粒體膜上相互作用[9]，從而使游離的Bcl-xL的表達增加。三者的表達有一定的聯(lián)系，在本研究中初步證實了這一點。我們發(fā)現(xiàn)，PKB與NF-κBp65、PKB與Bcl-xL、Bcl-xL與NF-κBp65的表達均存在相關(guān)性，有統(tǒng)計學意義。說明了PKB可能作為抗凋亡信號激酶，激活NF-κB，并引發(fā)其后的一系列抗凋亡效應(yīng)，銀屑病的發(fā)生可能與三者的共同參與有關(guān)。這為進一步明確銀屑病的發(fā)病機制，尋找新的防治靶點提供了新的思路和途徑。

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