依普利酮對自發(fā)性高血壓大鼠心肌縫隙連接蛋白Cx43表達的影響及干預(yù)

譚力力 于 波* 李 璐 趙紅麗 郭 旭

1 沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院心內(nèi)科（110002）

2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（110000）

3 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院（110000）

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）是一類重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于多種組織。RAS系統(tǒng)在生理情況下對血壓調(diào)控、水鹽代謝起著重要作用，而在病理情況下，組織中RAS增加與高血壓、動脈粥樣硬化、細胞凋亡、心力衰竭等密切相關(guān)。而縫隙連接蛋白43（Cx43）是心室肌細胞含量最豐富的連接蛋白，其表達水平的降低和分布異常，可使心肌細胞間的傳導(dǎo)發(fā)生改變，形成折返環(huán)路而發(fā)生室性心律失常[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭患者心肌中Cx43基因和蛋白表達都明顯下調(diào)，其表達分布的異常將引起惡性室性心律失常和心源性猝死的發(fā)生[2]。長期的高血壓可以導(dǎo)致心肌纖維化和左室重塑，而高血壓與Cx43及醛固酮受體拮抗劑對其的干預(yù)機制卻鮮有報道，因此本實驗采用Wistar大鼠和SHR大鼠為模型，就醛固酮對Cx43表達的影響及依普利酮對其的干預(yù)作進一步的研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及藥品

取20只8周雄性自發(fā)性高血壓大鼠（體質(zhì)量200g左右）分為高血壓組（A組），依普利酮組（B組），每組10只，再取同周齡雄性Wistar大鼠（均購于北京維通麗華公司）10只（C組），次日晨B組空腹加喂依普利酮（購于博士德公司），100mg/（kg·d）[3]灌胃；A組和C組給予生理鹽水灌胃，均喂養(yǎng)8周。

1.2 在體研究

分別于喂養(yǎng)2、4、6、8周采用大鼠尾動脈測壓儀測量大鼠尾動脈壓，比較血壓的波動情況。

1.3 標本采集及處理

取部分心肌組織置于40g/L中性甲醛液中固定，石蠟包埋，取2張切片，其中1張用于HE染色，以觀察心肌組織的大致形態(tài)及纖維化程度，另1張用于免疫組織化學(xué)染色，觀察Cx43分布情況。

1.4 心肌HE染色

首先，將切片放于85℃烤箱內(nèi)，烘烤切片約10min；然后，將該切片浸泡于二甲苯中10min，后更換二甲苯再浸泡10min，再水洗；用1%的蘇木素中染色3min；放入鹽酸酒精濃度1%進行分色，再流水沖洗反藍；用0.5%伊木紅染液進行染色3min，再流水沖洗，放入雙蒸水，樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌纖維化的變化程度。

1.5 心肌Cx43 的分布情況采用免疫組織化學(xué)方法觀察

實驗步驟按試劑說明書進行（試劑購自博士德生物工程公司）。用彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，對Cx43 表達分布進行觀察分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血壓比較

3組大鼠尾動脈血壓顯示，高血壓組平均動脈壓較Wistar組顯著升高；依普利酮組平均動脈壓較高血壓組顯著降低，而和Wistar組無顯著差異（比較中P＜0.01），見表1。

表1 組大鼠尾動脈血壓比較（mmHg）

2.2 各組大鼠心肌病理的變化

大鼠心肌組織纖維分布正常對照組均勻纖細；高血壓組心肌纖維排列紊亂、纖維粗大，而依普利酮干預(yù)后，心肌纖維化程度明顯改善（圖1）。

圖1 各組大鼠心肌病理的變化

2.3 免疫組織化學(xué)學(xué)染色

染色后，觀察Wistar組心室肌Cx43陽性的縫隙連接蛋白（棕色顆粒狀）分布密集，排列規(guī)律，位于心肌細胞長軸的彼此連接處，而高血壓組Cx43在心肌細胞的分布呈側(cè)邊化，依普利酮組Cx43分布不均、程度明顯減輕（圖2）。

圖2 心肌Cx43免疫組織化學(xué)染色觀察

3 分 析

目前，高血壓以經(jīng)成為臨床一種常見病、多發(fā)病，長期的高血壓可以導(dǎo)致心室重塑和心肌纖維化，心室肥大、心力衰竭。心肌肥大明顯增加心血管病病死率，其機制與心肌肥大所致的電生理重構(gòu)有關(guān)。而細胞縫隙連接（Gap Junction，GJ）是心肌細胞間惟一具有電連接作用的細胞間連接形式，對細胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過程也起著重要的調(diào)控作用[4]。在連接蛋白中，其中Cx43 在心肌中最為重要，Cx43和分布的異常是多種心律失常的基礎(chǔ)。

RAS系統(tǒng)的激活，一方面可導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加，細胞內(nèi)Ca2+含量增加可激活Ca2+依賴的蛋白酶Calpains，導(dǎo)致溶酶體釋放[5]，而且可激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calaineuin，CaN），使Cx43肽鏈C端368位點去磷酸化，從而使Cx43降解增加，含量降低。Cx43降解后重新分布，多數(shù)轉(zhuǎn)移到細胞側(cè)邊，正如實驗結(jié)果所示：正常心肌Cx43陽性的GJ分布密集，排列規(guī)律。而高血壓組心肌縱切面縫隙連接蛋白分布紊亂，甚至缺如。從而使心肌細胞各向性的傳導(dǎo)不均衡，電傳波不一致，導(dǎo)致傳導(dǎo)速度和方向改變，產(chǎn)生折返性心律失常。上述變化尤以心室肌明顯，考慮與Cx43主要分布在心室有關(guān)。長期的高血壓可導(dǎo)致心室重塑，而Cx43主要分布在心室，可以推出高血壓大鼠心肌Cx43數(shù)量減少，分布紊亂，與本實驗相符，而給予醛固酮受體拮抗劑依普利酮干預(yù)后，Cx43較高血壓組比較，數(shù)量增加，分布規(guī)律。推測其作用機制可能是通過抑制醛固酮的釋放進而降低心肌細胞內(nèi)Ca2+水平，抑制與Ca2+有關(guān)的蛋白酶的合成、釋放，減輕Cx43的降解，從而減輕Cx43分布紊亂程度。

醛固酮受體拮抗劑一般用于心功能不全和高血壓左室肥厚患者，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在使用螺內(nèi)酯后缺血/再灌注心律失常的發(fā)生率降低，顯示醛固酮受體拮抗劑具有一定的抗心律失常作用。許多學(xué)者認為，醛固酮受體拮抗劑防治室性心律失常的作用機制主要與抗心室心肌纖維化、抗結(jié)構(gòu)重構(gòu)和抗電重構(gòu)等機制有關(guān)。有研究顯示，Cx43表達和分布異?？梢詫?dǎo)致細胞間傳導(dǎo)減慢和電傳導(dǎo)耦聯(lián)能力的下降，從而引起多種心律失常。本研究發(fā)現(xiàn)，使用依普利酮后，高血壓所致Cx43含量減少的程度較未用藥組減輕，分布不均一改善，提示醛固酮受體拮抗劑能有效減輕心室Cx43的重構(gòu)，但其具體機制需做進一步的研究。

[1]Gutstein DE,Morly GE,Tamaddon H,et al.Counduction slowing and sudden arrhythmic death in mice with cardiac restricted inactivation of connexin43[J].Circ Res,2001,88(3):333.

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[3]任志龍,梁偉,胡鳳琪等.依普利酮對醛固酮灌注大鼠腎小球細胞凋亡的影響[J].臨床腎臟病雜志,2008,8(5):223-226.

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[5]張家明,李大強,于世龍等.坎地沙坦對家兔快速心房刺激所致縫隙連接蛋白40的影響[J].中國心臟起搏與心電生理雜志,2005,19(5):385-387.