腸型點狀氣單胞菌和魚害粘球菌融合子的構(gòu)建

鐘蕾，肖克宇*，戴良英

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院；b.生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

草魚(Ctenopharyngodon idellus)腸炎病、爛鰓病是對草魚危害最大的細菌性疾病，目前主要依賴抗菌類藥物進行治療.爛鰓病菌苗和多聯(lián)佐劑疫苗對草魚腸炎病、爛鰓病的防治效果較好，但存在效果不穩(wěn)定和制造成本高等問題.將微生物原生質(zhì)體融合方法應(yīng)用于動物致病微生物方面的研究[1-4]較多，這為發(fā)展細菌原生質(zhì)體融合技術(shù)，研制細菌多聯(lián)弱毒菌苗探索出了一條新的途徑.筆者采用原生質(zhì)體融合技術(shù)將草魚爛鰓病和腸炎病的病原菌進行融合，選育遺傳性穩(wěn)定的融合子，旨在為制備病原菌融合疫苗提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

(1)供試菌種.腸型點狀產(chǎn)氣單胞菌 58-20-9菌株，魚害粘球菌 G4菌株，均由中國科學(xué)院水生生物研究所提供.

(2)培養(yǎng)基.完全培養(yǎng)基：蛋白胨 11%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，葡萄糖0.5%，pH值7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min (固體培養(yǎng)基加瓊脂2%).再生培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L甘露醇，0.02 mol/L六水氯化鎂，0.02 mol/L順丁烯二酸，pH值 6.7，115 ℃滅菌 20 min (固體培養(yǎng)基加瓊脂2%).雙抗選擇培養(yǎng)基：在再生培養(yǎng)基中加入慶大霉素3 000 IU/mL和紅霉素50 IU/mL.

(3)主要試劑.EDTA溶液：0.1 mol/L乙二胺四乙酸鈉，pH值8.0.SMM緩沖溶液：蔗糖0.5 mol/L，MgCl20.02 mol/L，順丁烯二酸0.02 mol/L，pH值7.5，121 ℃滅菌20 min后備用.SMMD溶液：SMM緩沖液中加DNA酶5 μg/mL，即配即用.PEG溶液：在SMMD高滲液中加入40%的PEG6000，pH值7.0.新生磷酸鈣溶液：K2HPO40.54 g，CaCl2H2O 29.4 g分別溶于100 mL水中，滅菌，使用時等體積混合，促進原生質(zhì)體的融合.高滲美藍染液：0.5 g美藍溶解于100 mL 0.5 mol/L的蔗糖溶液中.

1.2 方 法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

將原始菌種接種至斜面完全培養(yǎng)基，活化后立即轉(zhuǎn)接至30 mL液體完全培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h備用.

1.2.2 耐藥性遺傳標記選擇及耐藥菌株培育與穩(wěn)定

耐藥性遺傳標記的選擇參見文獻[5].耐藥菌株的進一步培育與穩(wěn)定采用逐步提高藥物濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)法[6]，將已耐受紅霉素和慶大霉素的雙親菌株，在完全培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，提高其耐藥性，并穩(wěn)定至選擇融合子的應(yīng)用濃度.

1.2.3 生長曲線的繪制[7-8]

供試菌株分別在液體完全培養(yǎng)基中 28 ℃振蕩培養(yǎng)，用分光光度計分別測定不同培養(yǎng)時間(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)的吸光度(OD600)，以O(shè)D600值為縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制兩親本菌株的生長曲線.

1.2.4 原生質(zhì)體的制備、融合及再生

原生質(zhì)體的制備、融合方法見文獻[10].

融合子的檢出：用影印法[10]，將長出的菌落移植在含紅霉素和慶大霉素的雙抗選擇培養(yǎng)基上，48 h后再次影印在雙抗平板上，使融合株充分分離，在第2次雙抗平板上長出的菌株，可初步認為是融合株.

原生質(zhì)體形成率=(未經(jīng)酶處理菌數(shù)－經(jīng)酶處理后剩余菌數(shù))/未經(jīng)處理的總菌數(shù).原生質(zhì)體再生率=(再生培養(yǎng)基上總菌數(shù)－經(jīng)酶處理后剩余菌數(shù))/原生質(zhì)體數(shù).融合率=融合子數(shù)/平均兩親本再生原生質(zhì)體數(shù).

檢出融合菌株后，在雙抗選擇培養(yǎng)基上用影印法連續(xù)傳代12次，每代在28 ℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d，最后長出的菌落可視為穩(wěn)定的融合菌株.

1.2.5 親本及融合菌株的DNA檢測

按文獻[11]方法提取親本菌株和融合菌株的DNA，并測定其含量，取 1 000 bp DNA Ladder Marker及各DNA樣10 μL 進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照.采用F檢驗法對DNA含量進行差異顯著性檢驗，用新復(fù)極差法進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 58-20-9菌株和G4菌株的對數(shù)生長期的選擇

由圖1可知，58-20-9菌株的對數(shù)生長中后期為5～6 h，G4菌株的對數(shù)生長中后期為6～7 h.

圖1 58-20-9菌株與G4菌株生長曲線Fig.1 Curves describing the growth of strains 58-20-9 and G4

2.2 溶菌酶質(zhì)量濃度和酶解時間對兩親株原生質(zhì)體形成率和再生率的影響

從圖2、圖3可以看出，原生質(zhì)體形成率隨溶菌酶質(zhì)量濃度增加而提高，但再生率呈下降趨勢.同時，原生質(zhì)體形成率隨酶解時間延長而增加，再生率則下降，因此，將58-20-9菌株和G4菌株的酶解質(zhì)量濃度確定為 4 mg/mL，酶解時間確定為 40 min.此時在較高的原生質(zhì)體形成率下原生質(zhì)體再生率也相對較高(圖3).試驗結(jié)果表明，58-20-9菌株的細胞壁比G4菌株的對溶菌酶更敏感.

圖2 溶菌酶質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體形成率的影響Fig.2 The effect of concentration on formation rate of protoplast

圖3 溶菌酶質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體再生率的影響Fig.3 The effect of concentration on protoplast regeneration rate

2.3 原生質(zhì)體融合及融合子的檢出

2.3.1 原生質(zhì)體融合

經(jīng)EDTA和溶菌酶脫壁后的58-20-9菌株和G4菌株的原生質(zhì)體呈球狀，與親本菌的短桿狀有明顯區(qū)別.當兩者的原生質(zhì)體混合后，在40% PEG6000與新生磷酸鈣液的促融下，在顯微鏡下可看到凝聚現(xiàn)象.當把出發(fā)菌株58-20-9和G4分別涂布在雙抗選擇培養(yǎng)基平板上，均不長出菌落.將融合的原生質(zhì)體涂布在高滲再生培養(yǎng)基平板上，細胞壁恢復(fù).48 h后待菌落長出再連續(xù)2次影印在含紅霉素和慶大霉素的雙抗選擇培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后長出較小菌落，即為兩親株的原生質(zhì)體融合體的再生菌.為了計算融合率，從高滲再生培養(yǎng)基上隨機挑取5 000個菌落，用滅菌牙簽點種于雙抗選擇平板上，培養(yǎng)48 h后于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)僅有 16個小菌落生長良好，視為融合子，融合率達4‰.

2.3.2 融合子穩(wěn)定性鑒定

點種500個融合子菌落在雙抗平板上，連續(xù)影印傳代，隨著傳代次數(shù)的增加，能在雙抗平板上生長的融合子數(shù)目逐漸減少，待傳代12代時，僅有1個融合子菌落仍生長良好，且能穩(wěn)定傳代，說明此融合子遺傳性穩(wěn)定.因在試驗中用DNAase排除了外源DNA的轉(zhuǎn)化，說明此融合株是由兩親本菌株原生質(zhì)體融合的結(jié)果，將該菌株定名為AM-l菌株.

2.4 親本菌株及融合菌株的DNA含量

3次測量的親本菌及融合菌株的 DNA含量見表1.由表1可知，OD260/OD280主要介于1.7～1.9，說明純度可靠，融合菌株AM-l的DNA含量均高于58-20-9菌株和G4菌株的DNA含量，經(jīng)檢驗，差異均達到了極顯著水平(P＜0.01).

表1 親本菌株及融合菌株的DNA含量Table 1 The DNA contents of the syncretic and parents fungus strains μg/mL

親本菌株與融合子DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖 4.融合子 AM-l菌株離點樣孔的距離明顯小于任一親本菌株離點樣孔的距離，說明融合子DNA的相對分子質(zhì)量比其親本的要大，初步證實了以上DNA含量測定結(jié)果.

圖4 菌株DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of agrose gel of DNA

3 討 論

細胞的生理狀態(tài)對原生質(zhì)體的形成及融合頻率有較大影響.處于對數(shù)生長期的細菌細胞壁中肽聚糖的含量最低，細胞壁對酶的作用最敏感，在同等條件下原生質(zhì)體制備率較高，但對數(shù)生長早期的細胞相對較為脆弱，受酶的過度作用會影響原生質(zhì)體的再生率[12].鑒于此，本試驗中兩親本原生質(zhì)體的制備均選用對數(shù)生長中后期的菌液，即58-20-9菌株培養(yǎng)5～6 h，G4菌株培養(yǎng)6～7 h，這樣不僅可獲得較多菌體，而且原生質(zhì)體的再生率也可得到保障.

在原生質(zhì)體制備過程中，菌體的預(yù)處理、酶解濃度和時間、滲透壓穩(wěn)定劑是3個制約性的因素[13].筆者采用EDTA加溶菌酶處理，對溶菌酶的濃度和酶解時間進行了優(yōu)選.試驗證明，58-20-9菌株和G4菌株的酶解濃度為4 mg/mL，酶解時間為40 min，此時在較高的原生質(zhì)體形成率下原生質(zhì)體再生率也相對較高.在維持原生質(zhì)體活力的條件下，一般以較低滲的介質(zhì)有利于融合[12].筆者在原生質(zhì)體制備中加入氯化鎂、順丁烯二酸、甘露醇等滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質(zhì)體破裂，同時也促進酶與底物的結(jié)合.2種原生質(zhì)體等量混合后，加入PEG處理后原生質(zhì)體仍呈球狀.

原生質(zhì)體融合后，融合子為抗性互補的雙耐藥菌株.筆者最初采用通常的直接法，即將融合后的原生質(zhì)體直接涂布于雙抗再生培養(yǎng)基上，但未得到融合子.后將融合后的原生質(zhì)體先涂在不含藥的再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，再用影印法轉(zhuǎn)到含紅霉素和慶大霉素的雙抗選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)才得到融合株.究其原因，可能是雙耐藥融合子的檢出需要有48 h的表型延遲期.Szxoboda[14]在研究小單胞菌原生質(zhì)體融合時也發(fā)現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象.出發(fā)菌的原生質(zhì)體在雙抗選擇培養(yǎng)基上亦能生長，這一特殊選擇主要是鑒別雜菌.雜菌在含2種抗生素的培養(yǎng)基上不能生長.若親本不生長，融合子生長，則說明該融合子未繼承原有特性.在原代融合平板上加入2種抗生素，可以保證生長的菌或者是形成雜合雙倍體或單倍重組體的真正融合，因此，對這些菌連續(xù)傳代 10次后仍不回復(fù)的可以認為是真正的融合子[15].對融合子及其親本的DNA含量進行測定及瓊脂糖凝膠電泳分析，證實了融合子的DNA含量高于任一親本，其運動位置明顯靠后，這也與劉玲等[16]的研究結(jié)果類似，但這些還不能完全從遺傳學(xué)上闡明融合子的遺傳規(guī)律，下一步在運用融合子開展規(guī)?；呙缟a(chǎn)之前，仍有待于應(yīng)用16srDNA等技術(shù)鑒定融合子AM-1菌株與親本的異同，并對融合子攜帶的隱性或顯性表達的遺傳信息及其可能影響融合疫苗免疫效果的相關(guān)性狀予以檢測.

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