背角無齒蚌(Anodonta woodiana)血細胞的分類

謝彥海，胡寶慶，文春根*

(南昌大學a.生命科學學院；b.實驗動物科學部，江西 南昌 330031)

目前，貝類免疫學研究主要集中在對其血細胞的分類及作用等方面[1].關于貝類血細胞分類的報道較多，對血細胞種類和數(shù)量的描述卻存在較大的分歧.軟殼蛤(Mya arenaria)和菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的血細胞通常被分成2種類型[2-3]；圓硨磲(Tridacna crocea)和淺溝蛤(Scrobicularia plana)的血細胞則被分為三類[4-5]；海灣扇貝(Argopecten irradians)的血細胞被分成四類[6]；櫛孔扇貝(Chlamys farreri)的血細胞甚至被分為六類[7].另外，文獻[8-11]報道，淡水貝類褶紋冠蚌(Cristaria)、橢圓背角無齒蚌(Anodonta woodiana)和三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)均有 4種類型的血細胞.背角無齒蚌(Anodonta woodiano)是淡水貝類中的優(yōu)勢種群，具有重要的經(jīng)濟價值[12].筆者通過活體血細胞觀察、細胞化學染色及透射電鏡觀察，對背角無齒蚌的血細胞進行分類，旨在為貝類免疫學研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

背角無齒蚌于2008年10—12月分批采集于江西省鄱陽湖，體長 6～12㎝.室溫下，在水簇箱內暫養(yǎng)3～5 d后開始試驗.

1.2 方 法

1.2.1 血淋巴收集

取健康蚌，用2.5 mL(0.6×25針頭)注射器從后閉殼肌取血.血淋巴以1∶2比例與Alsever’s液(葡萄糖20.8 g/L，檸檬酸三鈉8.0 g/L，氯化鈉22.5 g/ L，pH7.2)混合，備用.

1.2.2 活體血細胞觀察

取血淋巴2.5 mL滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，靜置約20 min，用Olympus CX41顯微鏡觀察.

1.2.3 Wrights染色血細胞觀察

取血淋巴2.5 mL滴于載玻片上，靜置30 min，吸去上層清液，晾干，滴加Wrights染色液染色10 min，加入等量的PBS，染色10 min，PBS沖洗，50%乙醇分色，晾干，中性樹膠封片后觀察.

1.2.4 血細胞超微結構觀察

取血淋巴20 mL，分裝于2個10 mL的離心管內，3 000 r/min離心10 min，除去血清，加2.5%戊二醛，固定1～2 h，以0.1 mol/mL的二甲胂酸緩沖液洗滌，1% OsO4后固定、酒精脫水，Epon包埋、Vltracut E型超薄切片機切片，在日立H-600型電子顯微鏡下觀察.加速電壓為60 kV.

1.2.5 血細胞計數(shù)

取30只健康蚌，每只蚌抽血1次，抗凝處理，用血球計數(shù)板計數(shù).每毫升血細胞數(shù)=測得血細胞數(shù)×50 000×稀釋倍數(shù).

1.2.6 血細胞大小測定

取抗凝血淋巴2.5 mL，滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在27 ℃培養(yǎng)箱內孵育20 min，用帶目鏡測微尺的光學顯微鏡測量血細胞直徑和核直徑，細胞直徑以除偽足外的最長軸為準，核直徑以核的最長軸為準.每種細胞各測100個.測量數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行多層比較分析.

2 結 果

顯微鏡下，背角無齒蚌明顯有兩大類型的血細胞：顆粒細胞和無顆粒細胞.顆粒細胞和無顆粒細胞又有不同的形態(tài)特征.根據(jù)細胞和胞質內顆粒的大小特征可以將顆粒細胞分為大顆粒細胞和小顆粒細胞.根據(jù)細胞大小和核質比的差異特征又可將無顆粒細胞分成透明細胞和淋巴樣細胞.

2.1 顆粒細胞

顆粒細胞明顯的特征是細胞質內含有許多顆粒，細胞核相對較小，核偏位，核質比低.

大顆粒細胞(Lg)：活體細胞為圓形或橢圓形，體積比其他血細胞大.細胞內有折光率高的大顆粒.細胞一般不伸出偽足或伸出很短的偽足.細胞核常被大顆粒所覆蓋.大顆粒細胞通常易破裂，出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象(封三圖1-A).Wrights染色后胞質內顆粒為嗜酸性，呈現(xiàn)紫紅色或鮮紅色，細胞核藍紫色(封三圖 1-a).電鏡觀察發(fā)現(xiàn)胞質內有許多電子密度高的大顆粒.細胞核呈橢圓形或圓形，染色質均勻.胞質內可見內質網(wǎng)和高爾基器等細胞器(封三圖2-a).

小顆粒細胞(Sg)：活體細胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形狀，細胞易變形，細胞伸出指狀或根狀偽足.小顆粒細胞明顯小于大顆粒細胞，胞質內含有較多的小顆粒，折光率較高(封三圖 1-B).Wrights染色后細胞表現(xiàn)出嗜酸性和嗜堿性兩種，嗜酸性小顆粒細胞的胞質為淡紅色，顆粒呈深紅色，細胞核深藍色.嗜堿性小顆粒細胞的胞質呈淡藍色，顆粒呈深藍色，細胞核藍黑色(封三圖1-b,c).電鏡觀察發(fā)現(xiàn)胞質內有許多電子密度高的小顆粒，細胞核呈圓形或腎形，染色質較均勻.細胞質內可見內質網(wǎng)、高爾基器等細胞器(封三圖2-b).

2.2 無顆粒細胞

無顆粒細胞明顯的特征是胞質內不含有顆粒或含有少量的顆粒，細胞核較大，核質比高.

透明細胞(HC)：活體細胞呈圓形或不規(guī)則形狀，伸出的偽足呈片狀或根狀.胞質內無顆粒或有少量顆粒，細胞核呈圓形或橢圓形(封三圖1-C).Wrights染色發(fā)現(xiàn)部分細胞呈嗜酸性，胞質為淡紅色，核為深藍色；另一部分細胞呈嗜堿性，胞質為淡藍色，核為深藍色(封三圖1-d,e).電鏡觀察到胞質內無明顯的顆粒，但有高爾基體，內質網(wǎng)等細胞器.細胞核橢圓形，內有濃縮的染色質(封三圖2-c).

淋巴樣細胞(LY)：活體細胞為圓形，很少伸出偽足，細胞體積相對其他血細胞的體積小，細胞內無顆粒，細胞核圓形，居中(封三圖 1-D).Wrights染色發(fā)現(xiàn)細胞呈嗜堿性，胞質為淡藍色，核為深藍色(封三圖1-f).電鏡觀察到細胞中電子密度低，無顆粒，細胞核為橢圓形或圓形，有濃縮的染色質.胞質內細胞器少(封三圖2-d).

2.3 血細胞所占比例

測得背角無齒蚌血細胞濃度為(2.42±0.38)×106/mL，其中小顆粒細胞和透明細胞為主要的細胞類型，所占比例分別為59.28%和27.74%.大顆粒細胞和淋巴樣細胞相對較少，所占比例分別為4.28%和8.7%.

2.4 血細胞大小

從表1可以看出，4種血細胞中大顆粒細胞的直徑最大，淋巴樣細胞的直徑最小.統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，4種血細胞的直徑存在顯著差異.淋巴樣細胞的細胞核直徑最大，小顆粒細胞的細胞核直徑最小，血細胞的核直徑之間沒有顯著差異.另外，淋巴樣細胞的核質比最大，大顆粒細胞的核質比最小.

表1 背角無齒蚌4種血細胞、核的直徑與核質比Table 1 Cell, nuclear diameter and N/C of hemocytes of A. woodiana

3 討 論

貝類血細胞的分類通常依據(jù)血細胞的形態(tài)特征[3-5]進行.由于其形態(tài)特征存在較大變化，因此，建議結合血細胞的生理生化特性及其功能進行分類[13].Cheng[14]認為貝類血細胞細胞質中含有許多顆粒的是顆粒細胞，胞質中沒有或有少量顆粒的是無顆粒細胞.事實上，貝類血細胞存在許多過渡類型[15].根據(jù)血細胞和細胞質內顆粒的大小，顆粒細胞還能夠分成大顆粒細胞和小顆粒細胞[3,6,16].劉東武等[17]利用流式細胞儀分析菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的血細胞，發(fā)現(xiàn)除了大顆粒細胞和小顆粒細胞外，還有介于兩者之間的血細胞，稱為中顆粒細胞.另外，根據(jù)細胞內顆粒的組織化學特性還能夠將顆粒細胞分為大嗜酸性顆粒細胞和小嗜酸性顆粒細胞或嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞[18].

筆者發(fā)現(xiàn)背角無齒蚌的顆粒細胞除了細胞和顆粒大小有較大差異外，顆粒細胞的形態(tài)及伸展情況也存在較大的差別.有些細胞很少伸出偽足，而另一些則常伸出根狀偽足，因此，筆者將背角無齒蚌的顆粒細胞分為大顆粒細胞和小顆粒細胞.Zhang等[6]和羅文等[10]通過透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)大顆粒細胞內含有電子密度高的大顆粒.在背角無齒蚌的大顆粒細胞中同樣發(fā)現(xiàn)了許多直徑較大的顆粒，電子密度也較高.Nakayama等[4]與沈亦平等[8]描述的漿液細胞也具有大顆粒細胞的類似特征，可能與本研究中的大顆粒細胞是同一類細胞.此外，Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)大顆粒細胞是多核細胞，而本研究與陳全震等[16]僅觀察到單核的大顆粒細胞，并且發(fā)現(xiàn)大顆粒細胞容易出現(xiàn)脫顆粒的現(xiàn)象.

小顆粒細胞是背角無齒蚌血細胞中數(shù)量最多的一類血細胞，細胞體積小于大顆粒細胞，胞質內含有大量的小顆粒，這與Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)的小顆粒細胞特征一致.筆者發(fā)現(xiàn)的小顆粒細胞吞噬細菌的能力強于其他3類血細胞，因此，認為小顆粒細胞是背角無齒蚌免疫防御的主要血細胞.

多數(shù)研究者認為，無顆粒細胞可以分為更多的亞群，其中一類亞群細胞的體積較大，細胞核較小，偏位，細胞數(shù)量也較多，細胞核內沒有明顯的顆粒，通常稱之為透明細胞或大透明細胞[4,6].筆者觀察到的透明細胞同樣具有這些特征.此類細胞在背角無齒蚌血細胞中的比例僅次于小顆粒細胞，并具有吞噬能力，可能也是背角無齒蚌免疫防御的主要血細胞之一.另外，在貝類血細胞中還有一類細胞體積較小，細胞核大，核居中，形態(tài)類似于哺乳動物的淋巴細胞，通常命名為小淋巴細胞[19]，也有稱為類淋巴細胞[9]、擬淋巴細胞[7]、淋巴樣細胞[16]、小透明細胞[6].一般認為該類細胞是未成熟的血細胞[19].筆者也發(fā)現(xiàn)了該類細胞.由于貝類沒有真正的淋巴系統(tǒng)，也無淋巴細胞，只有類似高等動物淋巴細胞的小型血細胞，因此，筆者根據(jù)該類細胞的特征稱其為淋巴樣細胞.

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